细胞凋亡及其控分子机制.ppt

三、流式细胞仪检测 flow cytometer （一）PI 单染 （二） Hoechst33342 / PI双染色 （三）Annexinⅴ/ PI双染色 流式细胞仪 flow cytometer荧光激活细胞分类器 fluorescent activated cell sorter, FACS ?Hoechst33342是双苯并咪唑家族成员，能特异性与DNA螺旋小沟中AT结合。它能被活细胞摄入，也能在摄入后被细胞排出。 活细胞对碘化丙锭（PI），溴化乙锭（EB）有拒染性，当细胞被这些染料着染，提示为晚期凋亡或坏死。 （一） PI 单染  细胞凋亡之初，由于核酸内切酶的激活，将DNA从核小体间切断，产生游离寡核苷酸片段。这些片段弥散到胞浆中，但是细胞膜完整，不能离开细胞。 乙醇固定，PBS洗涤，使细胞膜通透性增加，并从细胞浆弥散出胞外。但是大分子DNA在胞内，不能被抽提。 坏死细胞中，DNA可染性并不立即下降，甚至反而增加，可能是由于细胞坏死时部分DNA变性，引起更多的可染位点。 原理： 收集细胞 ，PBS洗涤 冷70％乙醇固定12 h以上 离心，PBS洗涤，400目筛网过滤 PI（含RNase）染色 流式细胞仪检测 ? 操作： 判断： 在直方图上，Go/G1期前有一个亚二倍体峰。 （检测晚期凋亡，但不