中华按蚊多态微卫星NA位点的筛选和特征研究　.docVIP

中华按蚊多态微卫星DNA位点的筛选和 特征研究 】目的：对中华按蚊多态的微卫星DNA位点进 行分离和筛选，并阐明其特征.方法：应用中华按蚊基因组 DNA的酶切片段与生物素标记的寡核苷酸探针杂交，亲合素 富集和超滤离心浓缩目的片段，扩增放大，克隆并测序， 构建中华按蚊微卫星DNA库.在其中挑选合适的微卫星位点， 建立扩增体系.应用中华按蚊现场样本扩增不同的微卫星位 点，聚丙烯酰胺凝胶电泳筛选具有多态性的微卫星位点.结 果：构建的中华按蚊微卫星D NA库中包含252条序列， GenBank注册登记号为EF620177?E F620298.其中，双核苷 酸重复最为常见，三核苷酸重复次之，多核苷酸重复少见; 含（CA）和（G T）重复的序列最多，重复次数最多可达56 次；完整序列占％，非完整序列占％，复合序列占％,其余为 非典型序列.设计了 22对引物扩增不同的微卫星位点，其 中20个位点产生特异的PCR产物，PAGE结果显示其中15 个位点具有多态性.结论：获得了中华按蚊新的多态微卫星 位点共15个，为中华按蚊群体遗传和其他相关研究提供了 分子标志. 关键词】中华按蚊；微卫星DNA 0引言 微卫星DNA是一类简单的短核苷酸串联重复序列，又 称简单重复序列，广泛分布于真核生物的基因组中，每间 隔10?50kb即存在一个微卫星DNA.微卫星DNA包括核心序 列和两侧的侧翼序列，通常核心序列重复单元长1?6bp， 重复次数为10?60次，其重复次数的差异导致微卫星DNA 具丰富的长度多态性［1-2］.微卫星DNA已经广泛应用于 研宄生物多样性、群体遗传结构、行为生态和亲缘关系等 ［3］，是一种理想的的分子标志.中华按蚊(Anophel essinensisWi edemann, 1828 )在我国分布广且种群数量大 是以往文献记载中疟疾和丝虫病的重要传播媒介［4-5］. 本研究拟构建中华按蚊的微卫星DNA库并筛选其中多态的 微卫星位点，为中华按蚊基因组学研究积累基础资料，并 为其相关研究提供新的分子标志. 1材料和方法 材料构建中华按蚊微卫星DNA库的样本为上海实验室 品系，由中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所提供. 现场中华按蚊采自云南思茅(20 17?08，n=10)、云南盐津 (2017707 , n二 10)和湖北武汉(2017?07，n=10 )，选择 雌性成虫为实验材料. 方法 微卫星DNA库构建基因组DNA的抽提参照Hammond等 的文献进行［6］，-20°C保存待用.基因组DNA经S au3AI酶 切，回收20 0?800bp的片段，力卩SAUL接头连接，接头序 列如下：SAULA?： G CGGTACCCGGGA AGCTTGG, SAUL B?： GATCCCAAG CTTCCGGGTACC GC.以 SAULA 为引物，连接产物作 为模板PCR扩增，反应液中含PCR缓冲液、mmol/LMgC 12, mmol/LdNT P，umol/L引物，U Taq酶（上海生工生物工程 有限公司）和2uL模板，在热循环仪（PTC?1 00，美国 ABI公司）上执行如下程序：72°C5m in后，94°Clmin, 67°C lmin和72°C2 min共32个循环，72 °C延伸5min.将扩增产 物变性后，与Biotin ?16?ddUTP （瑞士Roche公司）标记的 寡核苷酸探针杂交，探针包括：（AAT）17，（GA ）25， （CCT）17, （AC）25, （CAG） 17, （CAC）5, （TC）10,帅8和（ TG） 18.用亲和素 Ve ctrexAvidinD （英国 VectorLab s 公司） 捕获并超滤离心（美国Millipore公司）浓缩富集杂交的 目的片段.以富集的核酸作为模板，SAULA为引物扩增，反 应体系和程序同前.随后，用PCR产物再次杂交、捕获、浓 缩富集和扩增.将上述扩增产物插入TOPO ?T载体（美国 Invit rogene公司），转化JM109，挑选含微卫星DNA序列的 阳性克隆，用四色荧光标记双脱氧链终止法测序 （PE2ABI37 70全自动测序仪，上海英骏生物技术有限公 司），应用BioEdit （Version）软件包分析所获序列. 微卫星DNA多态位点筛选单蚊抽提现场中华按蚊基因 组DNA，参照文献进行分子鉴别确认蚊种为中华按蚊[7]. 选择2 2条重复次数较多，且典型的微卫星DNA序列，应用 Primer3 （Vers ion）软件包设计引物.以单蚊基因组DNA为 模板，PCR扩增微卫星DNA （反应体系和程序同前），退火 温度范围在55°C?6 0°C.扩增产物经5%聚丙烯酰胺凝胶电 泳后，银染、显色，依据凝胶上的条带判断其是否具有多 态性. 2结果 中华按