中国7市家蝇rNAITS2基因分析　.docVIP

中国7市家蝇rDNA?ITS2基因分析 ：胡佳林郑学礼陈晓光 】目的：分析我国7市家蝇的rDNA?ITS2基因. 方法：采集北京、吉林、长春、成都、南京、湖北荆州和 养殖7市8个家蝇样本，形态鉴定.依据 Drosophilamel anogas ter的nrRNA序列，设计扩增不同地 区家蝇rDNA?ITS2基因的引物，PCR扩增不同地区家蝇基因 组，获特定基因片段，SSCP分析.将PCR扩增不同地区家蝇 rDNA?ITS2片段克隆于pMD ?18T载体，序列测定，采用 ClustalW软件在线分析不同地区家蝇rD NA7ITS2序列，用 M egAlignO软件的UPMGA方法构建系统发育树.结果：我国 7市8个家蝇样品的rDNA?IT S2基因均获约360bp阳性扩 增区带.SSCP分析8个家蝇样品的rDNA ?ITS2的SSCP电泳 DNA迁移率均有一定差异.ClustalW比对分析不同地区的8 个家蝇rD NA?ITS2基因序列间存在一定差异.同源性为7 5%， 而其中部分地区家蝇样品rDNA?ITS2序列同源性高，家蝇 （长春、吉林、养殖），三者之间的同源性为％~%;家蝇（成都、南京、广州、荆州）之间的同源性为°广%.系统聚类分析显示，发育树共分成2支，1支是家蝇（北京与养殖）关系密切，先聚为一类，然后与家蝇（长春）再聚类；另1支是家蝇（成都与荆州）关系密切，最先聚类，然后与家 蝇（南京）聚类，再与家蝇（广州）聚类，最后与家蝇 （吉林）聚类.结论：应用PCR?S SCP和rDNA?ITS 2基因序 列分析揭示我国不同地区家蝇基因组序列存在一定差异. 关键词】家蝇；不同地区；SSCP ； rDNA?ITS2；序列 分析 0引言 家蝉（M uscadomestic aLinnaeus ）属于双翅目 （Diptera）蝇科（Muscidae）家蝇属（MuscaLin naeus）,是 常见的一种嗜尸性蝇类.在法医检案中，准确鉴定嗜尸蝇种 类及所属地理种群，为推断死亡间隔时间和地点提供依据 [1].随着分子生物学技术的迅猛发展，为动物、植物等 生物种类鉴定和系统发生提供了新方法.根据18S，，28S基 因序列保守性，便于设计引物扩增ITS 1和ITS2片段，是 种下分类、近缘种鉴别、系统发育分析的理想分子标记.我 们分析了我国六省区家蝇I TS2序列变异，为探索家蝇种间 及种内分子分类和系统发生提供佐证，对法医检案精确鉴 定嗜尸性蝇种类及判断家蝇所属地理种群，进而推断案发 地点和死亡间隔时间提供依据. 1材料和方法 材料家蝇样品采自我国2017年7市，记录采集样品时 间、地点、地理位置.广州、长春、吉林3个地区蝇类是采 集于腐臭猪尸体和鱼肠做诱饵的诱笼捕获；其它城市与地 区蝇类是采用网捕方法采集.应用形态学特征进行种类的鉴 定，然后将采集标本放入_20°C冰箱储存备用，用于DNA提 取.具体步骤见 ［2］，用TE溶解DNA，4°C储存备 用. 方法rDNA?ITS2基因扩增引物设计根据Droso philamelanog aster 的 nrRNA 基因序列（Accessio nnumber:M210 17）为模板，用软件设计引物：MDF1上游: 5 z ?TGCTTGGACTA CATATGGTTGA? 3 ; MDR1 下游： 5 ?GTAGTCCCATA TGAGTTGAGGTT ?3z . PCR 反应体系为25 u L， 其组成：DNA模板10?lOOng，每一引物浓度约lOpmol /L, 每一/L，1 X 反应缓冲液［200mmol/ LTris?HCl, 10 Ommol/LKCl, 2 0mmol/LMgC12 , lOOrnraol/L （N H4S04） ］，lUTa qDNA聚合酶（大连宝生物工程有限公司），经过比较PCR的 程序确定为：9 4°C5min（预变性），94°C变性30s, 53°C退火 30s, 72°C延伸，30个循环，最后72°C延伸产物经12g/L琼 脂糖凝胶电泳后切下目的片段，用Omega公司GelE xtractionKit试剂盒回收，纯化后的片段与PMD918T载体 （大连宝生物工程有限公司）连接，16°C条件下反应12 h后 转化大肠杆菌DH5a菌株，转化后的菌株在Am p+的LB培养 基上选择培养，挑选阳性克隆摇菌培养，提取转化质粒， 使用PC R方法分析插入片段的大小，鉴定是否有目的片段. 目的片段测序工作由Invi rtrogen生物科技公司完成.对 PCR扩增产物进行SSCP银染检测，取扩增产物10mL加等量 上样Buffer （甲酰胺：lg/L溴酚蓝：300m L/L甘油=5 : 2 : 3），沸水浴lOmin，立即冰浴5min, 50g/L非