全人源食管癌单链抗体sFv基因文库的构建..docVIP

全人源食管癌单链抗体scFv基因文库的构建 ：段红唐树彬，庞华，彭志平，李少林 】 目的制备全人源化食管癌单链抗体sc Fv基 因文库。方法取食管癌病人癌肿周围淋巴结作为B细胞的来 源，提取总RNA，用RT PCR的方法获得抗体可变区基 cDNA文库。首先分别网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的 引物对，以cDNA为模板扩增VH和VL基因片段，再以它们 为模板分别扩增VH linker与VL linker，用SO E PCR技术将它们拼接成scFv，再引入酶切位点Sfil和Notl, 胶回收PCR产物获得scFv。将scFv基因克隆入噬菌粒载体 pCANTAB 5E后电转入Ecoli TGI。PCR法鉴定抗体基因插 入率，％琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆酶切产物。结果食管 癌周围淋巴结的提取总RNA琼脂糖电泳结果中可见清晰的 28S、18S条带；VH基因的大小约为450bp，VL基因为350bp, 组装后的s cFv基因约为850bp。PCR连接产物的转化效率 为2X107cfu/ug，scFv的阳性插入率为°/。(22 / 24)。结论 食管癌相关的人源单链抗体基因文库的构建为进一步筛选 单链抗体库奠定了基础。 关键词】噬菌体抗体库；单链抗体；食管癌；基因 工程抗体 1材料和方法 材料总RNA抽提试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司、 cDNA合成试剂盒RNAPCRKit(AM V)购自大连宝生物工程有限 公司、DNAlOObp Marker购自上海生工生物工程技术服务有 限公司，DNA纯化试剂盒(W5 211)购自上海华舜生物工程有限 公司、SHI 和Notl 内切酶、T4DNA 连接酶、TaKaRaExTaqTMHS 均购于大连宝生物公司；载体pCANTAB 5E和大肠杆菌TG1 均购自 Amersh amBioscience s 公司。 方法 淋巴结总RNA的提取食管癌病人手术时取癌肿周围淋巴 结，无菌生理盐水漂洗后，剪成约大小的组织块，立即放入 盛有液氮的冰瓶中，取回后立即进行总RNA的提取或放入液 氮中保存。淋巴结的裂解及RNA的纯化按试剂盒说明操作， 将获得的RNA贮存于-70°C。琼脂糖电泳判断RNA的完整性， 分光光度仪测A260/A2 80判断RNA的纯度。 确定扩增VH和VL基因引物对引物序列中的简并符号采 用 IUPAC 命名方式：R=A 或 G;W=A 或T;K=G 或 T;Y=C 或T;S=G 或C; H=A或C或T;N=A或C或G或T，引物参照文献［1，2 ］设 计，引物委托北京三博远志生物技术有限责任公司合成，为 PAGE纯化产品。引物浓度的计算：PCR反应中引物工作浓度 为O1 O 网格筛选确定扩增VH和VL基因片段的引物对IgG特异 VH和VL基因片段扩增：用扩增重链可变区和扩增轻链可变 区的每一个后引物和每个前引物交叉配对做PCR，然后分别 将PCR产物电泳，确定扩增VH和VL基因片段的引物对。 扩增重链可变区引物对：HuJH3F0R: 5’ TGAAGAGACGGT GACCATTGTCCC 3 ’ HuVH5aBACK: 5 ’ GAGGTGC AGCTGTTGCAGT CTGC 3’扩增轻链可变区引物对：Hu J k 2F OR: 5’ ACGTTT GATCTCCAGCTT GGTCCC 3 ’ HuV k 5aBACK ?? 5 ’ G AAACGACACTCA CGCAGTCTCC 3 ’ 扩增 VH linker 引物对： HuJH4 5L inker: 5 ’ AGA GCCACCTCCGCC TGAACCGCC TC CACCTGAGGAGA CGGTGACCAGGG TTCC 3 ’ HuVH5 aBACK： 5’ GAG GTGCAGCTGTTG CAGTCTGC 3’ 扩增 VL linker 的引物对：Hu J k 2F0R: 5 ’ ACGTTTGAT CTCCAGCTTGGT C CC 3’ Linker HuV k 2 3 6BACK: 5’ GTTCA GGCGGAGGTGGC TCTGGCGGTGGC GGATCGGAWRTT GTGHTGACKCAG TC TCC 3’引入酶切位点的引物：HuVH5 aBACKSfi: 5’ GTCCTCGCAACT GCGGCCCAGC C GGCCATGGCCCA GGTGCAGCTGTT GCAGTCTGC 3 Hu Jk 2FORNot: 5 ’ GAGTCATTC TCGACTTGCGGC CGC ACGTTTGA TCTCCAGCTTGG TCCC 3 PCR逆转录反应A①按下列组成配制反转录反应液： MgC 122 p 1，10 X RTB ufferl p 1，RNa seFreedH20 u 1，