提RNA+逆转录+qRT-PCR步骤模板.docVIP

【一、提RNA】 一、实验准备： 1、试剂：75%乙醇、Trizol、1.5mL 进口EP管、氯仿、异丙醇、进口枪头(RNA专用)、 2、配75%乙醇(DEPC水+无水乙醇)，放-20℃冰箱预冷； 3、预冷离心机(1.5mL EP管用的)； 4、清洁桌面，酒精喷过之后擦干，新手套、两层口罩； 二、操作步骤： 01、弃上清（不回收，直接倒去）； 02、1mL/孔 PBS洗两遍（不回收，直接倒去，随后用200μL枪吸尽PBS）； 03、每孔加500μL Trizol，轻晃，随后室温放置2min左右； 04、枪头吹打，吸出放入1.5mL 进口EP管； 05、加入100μL氯仿(即1/5体积的trizol)； 06、4℃离心机，12000g，15min； 07、吸200μL(可减少)上清放入新的1.5mL 进口EP管中（注意：只能吸到上清）； 08、加入等体积异丙醇，充分混匀，常温放置10-30min(15min)； 09、4℃离心机，12000g，10min； 10、倒掉液体，加入1mL预冷的75%乙醇剧烈混匀； 11、4℃离心机，7500g，5min； 12、倒掉上清，加入1mL预冷的75%乙醇，混匀； 13、4℃离心机，7500g，5min； 14、倒掉上清，倒扣在餐巾纸上，5-10min，用针头或者200微升枪头去掉管壁上的水珠； 15、每管中加入40μL(40μ-60μL)的DEPC水，吹打溶解； 16、测浓度（先知楼21楼测RNA浓度，带DEPC水、灭菌的dd水、10微升枪和枪头）； 三、注意事项 01、如果当时不测RNA浓度，可暂时把RNA放在-20℃冰箱。但长时间(24h)保存，需要放在-80℃冰箱； 02、异丙醇作用是沉淀RNA，作用比乙醇好； 03、 04、 05、 06、 07、 08、 09、 【二、测RNA浓度】 一、实验准备： 01、先知楼21楼-2109教室，一个冰盒+DEPC水+10微升枪、灭菌dd H2O、10μL枪头(RNA专用)、本子+笔； 二、操作步骤： 01、登记； 02、打开电脑==打开“N”软件==点击“Nucleic acid”==选择“OK”==选择“RNA”； 03、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干； 04、DEPC水 校零：即加DEPC水一滴，点击“Blank”，擦干； 05、测RNA：加样品一滴，点击“measure”，擦干，随后加下一个样品； 06、记录数据，包括RNA浓度（1000ng/μL）、260/280； 07、灭菌dd H2O清洗2-3遍，擦干； 08、-80℃冰箱保存； 三、注意事项 230nm代表 HYPERLINK /cpro/ui/uijs.php?adclass=0app_id=0c=newscf=1001ch=0di=8fv=18is_app=0jk=3d10a9164843a066k=%D3%D0%BB%FA%CE%EFk0=%D3%D0%BB%FA%CE%EFkdi0=0luki=7mcpm=0n=10p=baiduq=baidusiteerror_cprrb=0rs=1seller_id=1sid=66a0434816a9103dssp2=1stid=9t=tpclicked3_hctd=1615258tu=u1615258u=/html/201305/5867686.htmlurlid=0 \t /html/201305/_blank 有机物水平( HYPERLINK /cpro/ui/uijs.php?adclass=0app_id=0c=newscf=1001ch=0di=8fv=18is_app=0jk=3d10a9164843a066k=%CC%BC%CB%AE%BB%AF%BA%CF%CE%EFk0=%CC%BC%CB%AE%BB%AF%BA%CF%CE%EFkdi0=0luki=4mcpm=0n=10p=baiduq=baidusiteerror_cprrb=0rs=1seller_id=1sid=66a0434816a9103dssp2=1stid=9t=tpclicked3_hctd=1615258tu=u1615258u=/html/201305/5867686.htmlurlid=0 \t /html/201305/_blank 碳水化合物)，260nm代表RNA 水平，280nm代表蛋白水平，260/230表示有机物量，260/280代表RNA提取量；1.A260nm 是核酸最高吸收峰的吸收波长，最佳测量值的范围为0.1-1.0。如果不在此范围，稀释或浓缩样品，使之在此范围内；如果吸光度小于0.05，检查是否存在操作因素（如移液不准确，样品内有悬浮物等）影响。DNA 样品的A260 吸光度值是否0.1。（请注意，