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实验一琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的与要求 学习与掌握DNA电泳的概念、分类以及技术方法，利用琼脂糖凝胶电泳检测DNA纯度、含量以及分子量，及分离不同大小DNA片段。 二、实验原理 带电颗粒在电场作用下，向着与其相反的电极移动，称为电泳。DNA 分子是两性电解质， 在高于其等电点的溶液（ pH8.0-pH8.3 ）中 ，碱基几乎不解离，磷酸基团全部解离， DNA 分子带负电荷，在电场中向正极移动。核酸分子在琼脂糖凝胶中泳动时，具有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。因此，核酸分子的迁移率由下列几种因素决定：（1）DNA的分子大小线状双链DNA分子在一定浓度琼脂糖凝胶中的迁移速率与DNA分子量对数成反比，分子越大则所受阻力越大，也越难于在凝胶孔隙中移动，因而迁移得越慢。 （2）DNA分子的构象。当DNA分子处于不同构象时,它在电场中移动距离不仅和分子量有关,还和它本身构象有关。相同分子量的线状、开环和超螺旋质粒DNA在琼脂糖凝胶中移动的速度是不一样的，超螺旋DNA移动得最快，而开环状DNA移动最慢。如在电泳鉴定质粒纯度时发现凝胶上有数条DNA带难以确定是质粒DNA不同构象引起还是因为含有其他DNA引起时，可从琼脂糖凝胶上将DNA带逐个回收，用同一种限制性内切酶分别水解，然后电泳，如在凝胶上出现相同的DNA图谱，则为同一种DNA。 （3）电源电压。在低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量的DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，片段越大，因场强升高引起的迁移率升高幅度也越大，因此电压增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb 的DNA 片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。 （4）离子强度影响。电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的电泳迁移率。在没有离子存在时（如误用蒸馏水配制凝胶），电导率最小，DNA几乎不移动；在高离子强度的缓冲液中（如误加10×电泳缓冲液），则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化或DNA变性。 溴化乙啶(Ethidium bromide, EB) 溴化乙淀（EB）是核酸的染色剂，DNA分子中形成荧光结合物， EB在紫外线照射下的发射荧光。荧光的强度与DNA的含量成正比，从而可以确定DNA片段在凝胶中的位置及估计出待测样品的浓度。 三、实验试剂与器材 （一）材料 电泳仪，电泳槽，样品梳子、琼脂糖等 （二）试剂及药品 TAE试剂、琼脂糖、GoldView 四、实验步骤 1、琼脂糖凝胶的制备：称取1g琼脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TAE缓冲液中，将该三角瓶置于微波炉中加热使琼脂糖溶解，冷却至50~60℃时，加入5μl GoldView，充分混匀。 2、胶板的制备： ①取有机玻璃内槽，洗净、晾干。 ②将有机玻璃内槽置于一水平位置模具上，安好挡板。 ③将温热琼脂糖溶液倒入胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表面形成均匀的胶层。在凝胶槽中放入梳子，注意调节好数字之间的距离。凝胶的厚度在3～5mm之间。 ④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳子，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-乙酸）工作液的电泳槽中使用，没过胶面1mm以上。 3、点样：用移液枪取5ul待测DNA样品，与loading buffer液混合均匀，小心地加入到凝胶上样孔中。 4、打开电泳仪，插好导线，电压110V，电泳30min。也可根据指示染料移动的位置，确定电泳是否终止。 5、电泳完成后切断电泳，取出凝胶，置于紫外透射仪上观察电泳结果，并照相记录。 五、实验结果 图. DNA琼脂糖凝胶电泳图 图中，1.泳道代表的是Marker 5.6.7.8.9 泳道是本组的实验结果。 六、讨论 由图可知，本组DNA条带还可以，不过还可以更清晰。主要可以从以下几条来改进： 点样的时候要小心，不要戳到点样孔。 称量的时候严格按照配方。 制胶的时候要等胶降到低于60℃之后再加入EB。