western-blot实验流程(自己整理).pdfVIP

Western Blot 实验步骤 1.制胶 2.细胞蛋白抽提步骤 1. 提前预冷离心机，溶解 lysis buffer ； 2. 将细胞沉淀置于冰上 ；1ml PBS 重悬，4℃离心 5min，（除去样中微量血清）； 7 3. 每 10 cells 加裂解工作液 100ul，轻轻重悬细胞沉淀 ； 4. 置冰上 10min，其间振荡 2-3 次； 5. 13000rpm 离心 10min，4℃ ； 6. 将上清转到小离心管中 ； 7. 取出 1ul，用于 Bradford 测定 3.蛋白定量 对照 样本 1 样本 2 200ul 工作液+100ul H2O 200ul 工作液+99ul 200ul 工作液+99ul H2O+1ul 蛋白裂解液 H2O+1ul 蛋白裂解液 200ul 工作液+100ul H2O 200ul 工作液+99ul 200ul 工作液+99ul H2O+1ul 蛋白裂解液 H2O+1ul 蛋白裂解液 测 OD 值 蛋白浓度（ug/ul）= （样本OD 值的平均值-对照 OD 值平均值）*斜率 4.计算样品体积 10 孔 15 孔 Lysate 20ul 12ul lysis buffer 5X loading 5ul 3ul total 25ul 15ul 总蛋白量 35ug 20ug 总体积 ≤30ul ≤20ul 5.蛋白变性 100℃，5min ；提前预热。中间打开盖子1~2 次。 6.上样电泳 （100V ，90min） 向电泳槽中加入电泳缓冲液，使两块玻璃内侧电泳液高于上样孔，外侧电泳槽内电泳 液浸没凝胶底部。玻璃板内侧液面高于外侧。然后开始上样，保证每孔总蛋白量在 30-50ug,总上样量小于 30ul,注意上样时间尽量短，避免样品扩散。 上样完毕，盖好电泳槽的盖子，注意正负极，并选择适当的电压进行电泳。通常在不 连续的系统中，上层浓缩胶的电泳电压(建议 70-80V)要低于分离胶电泳电压(建议 90- 110V)，以达到更好的浓缩效果，使样品进入分离胶时被压缩在同一水平线上。电泳直 至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处停止电泳，电泳时间约 2-3 小时。电泳时间根据具 体情况定。 7.转膜（250mA ，1h 30min） 转膜顺序：阴极碳板+海绵+三滤+胶+膜+三滤+海绵+阳极碳板 湿式电转膜 1. 电泳结束后取出凝胶，在转膜缓冲液中漂洗数秒。 按 “三明治”模式， 打 开电转印夹，每侧垫上一块专用的用转膜液浸泡透的海绵垫，再各放一块转膜 液浸透的快速高效蛋白转移垫(定性滤纸），将凝胶平放在阴极侧滤纸上， 最后将转膜液浸透博士德硝酸纤维素 NC 膜平放在凝胶上，去除气泡，夹好电 转印夹，注意 NC 膜与胶， NC 膜与滤纸，滤纸与胶之间不可有气泡。 2. 转印槽加满转膜缓冲液，插入电转印夹，将转印槽放入冰箱内（ -20℃）， 确保 NC 膜最靠近正极，带负电的氨基酸和蛋白质向正极迁移。 3. 转膜选择恒流，每个转印槽建议电流为 150-300mA,时间依据胶的浓度适当调整。 8.丽春红染色 转膜结束后，先用笔标记 marker，再将 NC 膜置于丽春红染色液中，室温 5-10 分钟 即可见红色条带，用洗涤缓冲液洗数次可洗掉红色条带进行后续实验。拍照。根据 marker 剪膜。 9.封闭 用 5%的牛奶（5g 脱脂奶粉溶解于 100ml Tris -PM 中）室温封闭 1 h ； 10.一抗孵育 按说明书稀释一抗，加入稀释好的一抗，室温孵育 2 h 或 4 ℃过夜；孵育结束后，回 收一抗。 11.洗膜 洗膜液洗 4 次，每次 1