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用分型的方法检测溯源副溶血性弧菌 　　【摘要】 目的 用分型的方法分析副溶血性弧菌的流行优势型，溯源其亲缘关系，为追踪感染源提供依据。方法 用诊断血清进行血清学分型，用PFGE和ERIC进行基因分型。结果 607株分离于海产品的VP分出10个血清群，有30株不能分型，分型率为94.64%，0：6群和0：5群为流行优势株；480株病人VP分为6个血清群，0：3群为流行优势株。377株分离于海产品的VP分成29个PFGE型；480株病人VP分成12个PFGE型。261株不同来源的VP分出42个ERIC基因型。结论 3种方法均能用于VP的分型，但各有特点。由于基因分型方法敏感性高、特异性强、分型率和分辨率佳的优点，将逐渐取代传统的表型分型技术。 　　【关键词】 副溶血性弧菌；血清学分型；PFGE分型；ERIC分型 　　1 资料与方法 　　1.1 菌株来源 收集食品来源的VP607株，病人和食物中毒VP480株，共计1087株。 　　1.2 试剂与仪器 ①试剂：TCBS琼脂为英国OXOID公司产品；弧菌显色培养基为科玛嘉产品；营养琼脂、碱性蛋白胨水等培养基为青岛海博生物技术有限公司产品；API20E生化鉴定试剂条为法国生物梅里埃公司生产；XbaⅠ酶购自大连宝生物公司。低熔点琼脂糖，PFGE级琼脂糖均为BIO-RID公司产品。蛋白酶K为MERCK公司产品。②主要仪器：CHEF MAPPER型脉冲场凝胶电泳仪（BIO-RID公司），VersaDoc型凝胶成像系统（BIO-RID公司）。 　　1.3 方法 　　1.3.1 菌株分离与鉴定 ①海产品和环境株VP分离采用筛检方法[2]；②腹泻病人菌株分离参照文献方法[3]；③菌株鉴定：用蔗糖、葡萄糖产气、6%NaCl胨水、阿拉伯胶糖4项对筛选可疑菌株进行复筛，凡阿拉伯胶糖阳性、葡萄糖不产气、蔗糖阴性、6%NaCl胨水生长的菌株，进一步作API20E生化系统鉴定，以区别其他弧菌和气单胞菌等细菌。 　　1.3.2 血清学分群[4] 按说明书操作。将1%氯化钠营养琼脂上的纯培养物，用生理盐水洗下，沸水浴煮沸20min，加热破坏菌体的K抗原，离心弃上清，然后用生理盐水洗涤3次，制成菌悬液，与副溶血弧菌“O”群分群血清作玻片凝集试验。 　　1.3.3 PFGE分型 参照美国PulseNet PFGE标准化方法[5]，①制胶块：2mlCSB（细胞悬浮液），挑取新鲜培养物，均匀悬浊，使菌液浊度至20%透射值。取200ul菌悬液至离心管中，37℃水浴5分钟，加入10ul蛋白酶K（20mg/ml），使其最终浓度为0.5mg/ml。置50℃水浴10min。将菌悬液与1%Gold Agarose（含1%SDS）等体积混合，将混合物加入模具孔中制成胶块，4℃10min冷却。②蛋白消化：3mlCLB（细胞裂解液）溶液加入15ul蛋白酶K（20mg/ml）（最终浓度0.1mg/ml），用模具梳子将胶块直接取出，投入CLB中54℃水浴2小时。弃液，加5ml50℃预热的纯水，轻摇至胶块悬起，50℃水浴轻摇10min，洗2次，5ml50℃预热的TE洗胶块4次，15min/次，凉至室温，加3mlTE，置4℃保存。③酶切：切1-3mm胶块，浸入150μl酶切体系中（其中含XbaⅠ酶50U），37℃过夜。④制胶：将酶切后的样品胶置于样品梳上，摆放到模具上。称取1gGold Agarose溶于100ml0.5×TBE液中，加热溶解后冷至60℃，缓缓倒入模具中，冷却20min后，拔去样品梳，去除挡板，将胶块放入已加入0.5×TBE缓冲液的电泳槽中。⑤电泳：电压6V/cm，电泳时间19小时，脉冲参数（2-10s，13h）：（20-25s，6h），电泳温度14℃。⑥染色：电泳结束后，将凝胶取出，用0.5μg/ml的Goldview染色30min，去离子水脱色30min。⑦读胶：用凝胶成像仪读胶分析。⑧结果判定：各菌株图谱间DNA条带数量和位置完全相同为同一型别，若有1条及以上的条带差别，即判为不同的型别，PFGE型别的排序是根据检测菌株发现电泳条带数目变化出现早迟排列，以阿拉伯数字表示。 　　1.3.4 ERIC-PCR分型[6] ①PCR模板制备：将副溶血性弧菌接种营养琼脂过夜培养，取菌落培养物悬浮于TNE缓冲液（10mM Tris，20mM NaCl，50mM EDTA，pH7.5），加入终浓度为0.5% SDS和100μg/ml proteinase K，55 C30 min，酚-氯仿-异戊醇（25：24：1）抽提DNA，异丙醇沉淀，70%乙醇洗涤，用TE buffer（10mmol/LM Tris-HCl，1mmol/L EDTA，pH8）溶解。②ERIC-PCR分型：采用Versalovic等报道的方法[7]。