石蜡包埋胃镜组织幽门螺杆菌菌体DNA探索性的研究.docVIP

石蜡包埋胃镜组织幽门螺杆菌菌体DNA探索性的研究 　　[摘要] 目的 探讨从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA的方法和策略。 方法 选取2008年5月～2010年5月中国医科大学263例胃癌术后石蜡包埋标本及2011年6月～2014年6月医学院附属中心医院和沈阳医学院附属第二医院206例幽门螺杆菌阳性石蜡包埋标本，利用试剂盒提取菌体DNA、PCR扩增，对扩增的结果进行统计分析。 结果 263例胃癌大体标本中， 231例检测出随意选取基因片段，阳性率为87.83% ；206例胃镜标本中，194例检测出幽门螺杆菌cagA基因，阳性率为89.81%。胃大体标本和胃镜标本DNA提取阳性率之间比较差异无统计学意义（P0.05）。 结论 从石蜡包埋胃镜组织中提取幽门螺杆菌菌体DNA是高效可行的。 　　[关键词] 石蜡包埋组织；幽门螺杆菌；DNA；基因扩增 　　[中图分类号] R735.2 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2016）08-0121-03 　　从胃癌术后石蜡包埋组织中提取人体基因组DNA已经广泛应用于各种回顾性研究，随着研究的深入和方法的改进，人们从石蜡包埋的少量胃镜组织也可获得较理想的DNA[1-3]，但国内尚未见从石蜡包埋胃镜组织提取幽门螺杆菌菌体DNA的报道，主要是由于胃镜组织块本身很小，并且H.pylori主要定殖部分胃小凹和腺体内，数量少之又少，限制了对H.pylori DNA特点的深入研究。目前为分析H.pylori的DNA，人们多采用胃镜获取新鲜胃黏膜，随即在培养基上进行涂抹，于体外进行细菌培养，从而获得菌体DNA，这样改变H.pylori生存的微环境，无形中增加了人为因素。因此，我们在从胃癌术后石蜡包埋组织中提取人体基因组DNA的研究基础上，进行多方面尝试从石蜡包埋的胃镜组织中提取H.pylori DNA。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料来源 　　263例胃癌术后石蜡包埋标本来自于中国医科大学（2008～2010年），206例胃镜石蜡包埋标本来自于沈阳医学院附属中心医院和沈阳医学院附属第二医院（2011～2014年）室温保存至今。 　　1.2 H.pylori的HE染色及特染 　　206例胃镜标本按常规方法每例标本制作切片3张，厚度为5 μm，分别进行常规HE染色、H.pylori特殊染色――吉姆萨染色（吉姆萨染色液G1010 北京索莱宝科技有限公司）和亚甲蓝（MST-8027 胃幽门螺杆菌染色试剂盒迈新试剂）染色。具体方法见试剂盒。 　　1.3 DNA提取方法 　　石蜡组织提取DNA采用的是北京基因公司的试剂盒（GT pureTMFFPE tissue DNA Extraction KIT NO. 56404），胃癌术后标本，每例标本连续切10～12片，每片厚5 μm，胃镜标本每例连续切18～20片，切片厚度为4 μm，放入1.5 mL离心管中，然后按试剂盒操作提取DNA。 　　1.4 PCR反应 　　胃癌术后标本随机选取一对基因进行PCR扩增，上游引物5’ CAA GCA GTC ATC CTT CTC TC 3’； 下游引物5’GCA CTT AGG GAT CCC AT GAA 3’； 扩增条件94℃ 7min，94℃ 30s，54℃ 20s，72℃ 30s，72℃ 10min，40个循环，4℃保存。 　　胃镜标本对H.pylori的cagA基因进行巢式PCR扩增。引物序列为cagA 1F 5’ CGT TGA TAA CGA TAG GGA TAA C 3’；cagA1R 5’ GAT CCC CAA ATT TCT GAA AGC TCT T 3’；cagA 2F 5’ CGA TAG GGA TAA CAG GCA AGC TT 3’；cagA1R 5’ CTG AAA GCT CTT TGT GGA AGA TTC3’两次PCR反应体系均为20 μL，其中含模板DNA 2 μL、10×PCR buffer 2.5 μL、dNTP 2 μL、引物1.25 μL、taq酶0.2 μL，去离子水补足到20 μL。第二次PCR中DNA模版为第一次PCR产物，PCR反应条件为：95℃ 5 min，95℃ 1 min，54℃ 1 min，72℃ 1 min，72℃ 5 min， 两次PCR各进行30个循环。 　　1.5 统计学方法 　　采用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，计数资料组间比较进行χ2检验，P0.05为差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　2.1 H.pylori判定 　　分别进行HE染色、亚甲蓝染色、吉姆萨染色，三者之一阳性，即为阳性，见封三图10、11、12。 　　2.2 胃镜标本和大体标本菌体 　　DN