分子生物学——因诊断.pptVIP

第十三章基因治疗原理与研究进展 基因治疗的概念 将某个遗传物质转移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以达到治疗疾病目的的方法。 基因治疗分类 体细胞(somatic cell)基因治疗 生殖细胞(germline)基因治疗 只限于某一体细胞的基因的改变 只限于某个体的当代 对缺陷的生殖细胞进行矫正 当代及子代 第一节 基因治疗的策略 第二节 基因转移技术 第三节 基因干预 第四节 治疗基因的受控表达 第五节 基因治疗的应用研究 第六节 基因治疗的问题与展望  第一节 基因治疗的策略 根据基因转移的途径不同，基因治疗分为： 1. ex vivo（经活体） 是指在体外将目的基因导入靶细胞，经过筛选和增殖后将细胞回输给患者，使该基因在体内有效地表达相应产物，以达到治疗的目的。 2. in vivo（活体内） 是指将目的基因直接应用于患者体内。 基因转移的两种途径 2. 逆转录病毒介导的基因转移系统 2. 逆转录病毒介导的基因转移系统 3. 逆转录病毒载体的特点 逆转录病毒携带的遗传物质高效地进入靶细胞。 逆转录病毒结构基因缺失，但不影响其他部分的活性。 前病毒通过LTR高效整合至靶细胞基因组中，有利于外源基因在靶细胞中的永久表达。 包装好的假病毒颗粒易于分离制备。 1. AAV的特点 以潜伏感染为主； 高效定点整合至人染色体中，避免随机整合可能带来的抑癌基因失活和原癌基因激活的潜在危险性。 第三节 基因干预 二、RNA干扰（RNA interference，RNAi） 由双链RNA诱发的基因沉默现象：与其有同源序列的mRNA被降解，从而抑制了该基因的表达。 四环素抗性操纵子系统 四环素操纵子中的抗性基因的转录受阻遏蛋白的负调控，而阻遏蛋白的活性又受到四环素药物的调控，其在四环素存在时会优先结合药物而无法与转录调控元件结合，即不能发挥阻遏转录的作用。 。 第一例基因治疗 ---腺苷脱氨酶缺乏症 生理：腺苷脱氨酶是一种细胞内酶，在核酸代谢中起重要作用，使淋巴细胞中的脱氧腺苷脱氨成为脱氧肌苷，最后代谢为尿酸，排出体外。 病理：腺苷脱氨酶缺乏→脱氧腺苷不能脱氨→脱氧腺细胞内堆积→淋巴细胞死亡→机体免疫功能缺乏。 腺苷脱氨酶基因位于20号染色体长臂 1983年腺苷脱氨酶基因被克隆 应用逆转录病毒可将该基因送入缺乏腺苷脱氨酶基因的淋巴细胞 新输入的腺苷脱氨酶基因可在原来没有此基因的淋巴细胞中表达 第六节 基因治疗的问题与展望 1. 安全性问题 1999年出现首例基因治疗失败事件。 目前只限于体细胞，提倡间接体内法、主要用于单基因遗传病治疗、疗效显著并经过动物实验验证等。 2. 社会伦理问题 禁止用于生殖细胞 防止不当应用（如体育上） 3.技术问题 目的基因及调控元件选择； 安全高效载体构建及转移技术； 靶细胞选择 ADA缺乏症的基因治疗 LTR ADA SV40 neo LTR 第一个成功接受基因治疗的人 Ashanti de Silva 其在前十个月先后注射了7次，治疗后ADA蛋白水平由最初的1%水平上升到25%。 三、病毒性疾病的基因治疗研究 可用基因治疗的策略 1．调节机体免疫应答 2. 基因干预，抑制病毒复制 2. 腺病毒载体缺点 不能整合到靶细胞的基因组DNA中。治疗基因表达时间相对较短。 宿主的免疫反应导致腺病毒载体表达短暂。 部分环节可能产生复制型腺病毒。 靶向性差。 （三）腺相关病毒（adeno-associated virus, AAV）载体 AAV是一类单链线状DNA缺陷型病毒。其基因组DNA小于5 kb，无包膜。AAV不能独立复制，只有在辅助病毒存在时，才能进行复制和溶细胞性感染，否则只能建立溶源性潜伏感染。 腺相关病毒基因组的结构 Ψ：包装信号序列； REP:病毒复制基因； CAP:编码衣壳蛋白的基因； ITR：反向末端重复序列 2. AAV载体的缺陷： AAV载体容量小，最多只能容纳5 kb外源DNA片段。 感染效率比逆转录病毒载体低。 在40%～80%的成人中存在过感染，可能会引起免疫排斥。 二、非病毒载体介导的基因转移系统 （一）脂质体介导的基因转移技术 基本原理：利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以自动形成包埋外源DNA的脂质体，然后与细胞一起孵育，即可通过细胞内吞作用将外源DNA（即目的基因）转移至细胞内，并进行表达。 脂质体介导的基因转移示意图 （二）受体介导转