大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定-生物化学与生物物理.PDFVIP

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 2009, 36(1): 72~76 大鼠胚胎神经干细胞单克隆化及单层化培养和鉴定 1) 2) 1) 1)* 丁道芳 邢三丽 周鸣鸣 宋后燕 1) 2) ( 复旦大学分子医学教育部重点实验室，上海200032； 复旦大学神经生物国家重点实验室，上海200032) 摘要 采用原代培养SD 胎鼠神经干细胞，在形成神经球之后，传代至0.1%明胶包被的培养皿，显微镜下挑取一个神经球贴 壁后的细胞团，吹打后贴壁培养 同样方法挑细胞团并传代培养5～6次，得到纯化的由一个神经干细胞扩增的克隆，对得 到的神经干细胞进行鉴定以及分化能力的评估，证明得到的细胞就是神经干细胞 结果表明，成功分离了SD 胎鼠的神经干 细胞，进行单克隆化单层培养，神经干细胞和分化后的细胞标志基因都可以检测到 上述工作为疾病模型大鼠治疗及相关基 础研究提供细胞来源及形态标准 关键词 神经干细胞，单克隆化，Nestin ，Sox2 ，GFAP ，Tuji 学科分类号 Q2-3 DOI: 10.3724/SP.J.1206.2008.00330 神经干细胞在神经发育和神经损伤修 疾病中 干细胞的分化 本研究是首次从胎鼠中分 得到神 发挥重要作用 一直以来，神经干细胞作为修 和 经干细胞进行单克隆化单层培养，在研究和实际应 代替受损脑组织的靶细胞来源，能有效改善疾病症 用方面来说，从胎鼠中分 得到的神经干细胞更具 状 除此之外，外源基因转导至神经干细胞可用于 有价值，同时本文也进一步说明不同来源的不同种 颅内肿瘤和其他神经疾病的基因治疗 神经干细胞 属的神经干细胞同样适用于贴壁单克隆化培养 对于判断药效及药物毒性等也发挥很重要的作用， 1 材料和方法 特别是对神经系统有毒性作用的药物，利用神经干 细胞培养技术可以观察到某些天 化合物和合成化 1 1 试剂 合物的神经活性，为发展小分子治疗药物提供理论 DMEM/F12、Neurobasal 培养基以及N2 和 基础 B27 购自Gibco 公司，表皮生长因子(EGF)及碱性 神经干细胞通常以神经球的形式悬浮在无血清 成纤维细胞生长因子(bFGF) 购自Peprotech 公司， 的培养基中生长，但此种方式有其缺陷性 首先， DAPI、明胶购自Sigma 公司，兔来源的Sox2 多克 形成球体的时候，内部的细胞未能接触到培养基中 隆抗体、小鼠来源的单克隆抗体Nestin 、GFAP 和 抑制分化的因子和营养成分，容易死亡和分化；其 Tuji 购自Chemicon 公司 次，当研究某个基因功能的时候，无法观察此基因 1 2 细胞培养 对细胞形态是否有影响，特别是促进分化和抑制分 取青春期SD 大鼠一 一雄合笼让其交配，次 化相关基因，无法观察细胞形态变化，也无法消除 日观察是否有白色的精栓形成，若有记为孕0.5 d. 干扰因素；最后，形成神经球的细胞有时不是单个 至孕 12 d 取胎鼠，脱臼处死，75% 乙醇喷洒躯干 细胞增殖而来，所以对实验数据的可靠真实性有很 部位 腹部 “T ”形切口，拉出“Y ”形的子宫， 大的影响 为此有必要对悬浮生长的神经干细胞球 可见胚胎成串珠样排列，子宫颈处剪断，置于 进行驯化贴壁生长 由于神经干细胞球贴壁后比较 10 cm 培养皿中，PBS 反 冲洗去除血细胞 细胞 容易分化，所以必须进行单克隆单层化扩大培养， 操作台上，眼科剪小心剪开子宫，取出胚胎，去除 并且对扩大培养的细胞进行鉴定 胎盘