细胞生物学之细胞凋亡以及调控分子机制.ppt

P53的结构： p53基因位于人染色体的17 p13.17，编码53kDa的P53蛋白转录因子； 野生型P53蛋白由393aa组成，活性形式为四聚体； 自N端起包括：转录活化区、DNA结合区、四聚体化区和C-调节区； C-端的26aa构成一个开放的结构域，易被降解或磷酸化修饰，受其他蛋白调节。 一、细胞自身蛋白的调控作用 （一）P53蛋白的调控作用 P53的表达与活性调节 正常状态下： 胞浆P53水平很低，半衰期很短， 胞内P53被严格监控，受HDM2的负反馈调节，并通过泛素降解途径调节P53水平。 异常情况下： 当细胞DNA损伤、纺锤体丝断裂、癌基因异常表达等细胞生存面临威胁时； P53水平迅速升高和活化； P53对细胞凋亡和细胞周期的调节作用 野生型P53蛋白： 具维持细胞生长、抑制恶性增殖的作用； P53蛋白作为“基因警卫”负责维持基因组的完整性、DNA损伤修复和细胞周期的正常运转； 如果损伤不能修复， P53就激活那些诱导凋亡的基因表达，使细胞进入凋亡状态。 突变型P53蛋白： 丧失抑制细胞恶性增殖功能，p53基因突变是50%以上肿瘤逃逸凋亡的重要原因; 并且本身具有癌基因功能。 P53蛋白——基因卫士 P53蛋白 解链酶 复制因子A P21蛋白 细胞停滞于G1期 细胞凋亡 酸性区 核心区 碱性区 P53蛋白 DNA损伤 P21基因 P53蛋白 抑 制 P53蛋白 成功修复 修复失败 细 胞 周 期 (二)Bcl-2基因家族 bcl-2基因 bcl-2基因发现于1985年。定位于18q21 基因长约230kb（2个内含子各3 个外显子），编码23kd膜镶嵌蛋白质，与Ced-9有23%的同源性。 Bcl-2对需要长期生存的细胞,如神经细胞、免疫记忆细胞和造血祖细胞等的寿命有重要意义。 急性淋巴细胞白血病，急性髓细胞白血病，慢性粒细胞白血病，细胞膜内Bcl-2蛋白质增加显著。 Bcl-2的功能 属凋亡抑制基因，阻遏细胞凋亡，延长细胞寿命，但对细胞周期和分化无影响 阻止或减少各种刺激引起的细胞损伤。如Bcl-2能阻止由r射线和多种化疗药导致的细胞凋亡。 Bcl-2蛋白具抗氧化作用 Bcl-2蛋白抑制细胞器内Ca2+ 离子向胞质释放，而凋亡必须有Ca2+ 离子参与。 bcl-2家族 家族成员 可能存在的聚合体形式 抑制凋亡 促进凋亡 bcl-2 Bcl-2/Bcl-2 Bax/Bcl-2 bcl-xL Bcl-xL/bcl-xL Bcl-2/Bcl-xL bax Bax/Bax Bax/Bcl-2 bad Bad/Bcl-2 Bad/Bcl-xL bcl-xs Bcl-xs/Bcl-2 Bcl-xs/Bcl-xL Mcl-1 Mcl-1/bcl-xL Mcl-1/Bcl-2 Bcl-2家族对细胞凋亡的调节机制 Bcl-2、Bax和Bcl-x组成一个凋亡调控系统 当Bax/Bax同源二聚体形成时，便诱导细胞凋亡； 随bcl-2表达量增加，渐多的Bax/Bax解聚，形成更稳定的Bax/Bcl-2异源二聚体，从而中和了‘Bax/Bax’诱导凋亡的作用。即Bax和Bcl-2 比值调节凋亡； 当Bcl-xs存在时，优先形成Bcl-xs/Bcl-2 ，使Bax/Bax形式保留，诱导细胞凋亡。 第四节 检测细胞凋亡的常用技术 一、凋亡的形态学检查（光镜、电镜） 1 苏木素—伊红（HE）染色法: 应用范围：石蜡组织切片、细胞涂片 结果判断： 正常细胞保持原生长形状，梭形或多角形；细胞核呈蓝黑色，胞浆呈淡黄色。 凋亡细胞表现为核染色致密浓缩、核碎裂；凋亡细胞涂片可见凋亡小体。 坏死细胞呈均质红染，无结构、核染色消失。 2. 甲基绿—派诺宁染色法: 3. Giemsa 染色法: 4. 瑞氏(Wright)染色法 5. 透射电子显微镜观察法 二、荧光显微镜观察法 吖啶橙染色法、 Hoechst染色法 Hoechst染色法 （一）琼脂糖凝胶电泳法 基本操作步骤： 染色体组DNA提取 1~1.5%琼脂糖电泳(含EB) 电泳后于紫外灯下观察并照相留底 有无200bp左右的ladder出现作为判断细胞凋亡 亦可进行聚丙烯酰胺凝胶电泳. 三、凋亡细胞的生化特征的检测 (二) 原位末端标记技术 (in situ end –lableing, ISEL) 原理: ISEL的原理是基于细胞凋亡时，DNA断裂，利用末端脱氧核苷酸转移酶（TdT）或DNA聚合酶将带有生物素标记的核苷酸（biotin-16-d