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联合试验的设计法优化辣蓼饲料添加剂生产工艺 　　摘要：辣蓼是一种传统的中药材，来源广泛，具有消炎、镇痛和抗氧化等多种生物活性。使用混料试验和正交试验联合的方式进行了辣蓼饲料添加剂的生产工艺优化，混料试验用于优化麦糟、辣蓼和木薯渣的物料配比，正交试验用于优化黑曲霉、酿酒酵母和枯草芽孢杆菌的接种配比。结果表明，混料试验待优化变量的方差分析均极显著，R2和调整R2均超过90%，模型拟合优秀。选择黄酮含量2.75 mg/g、总酚含量3 mg/g、蛋白质含量28%和蛋白质增量40%作为多重响应的临界条件，得到满足条件的物料配比为麦糟 ∶辣蓼 ∶木薯渣=59 ∶10 ∶31。正交试验的单一效应不显著，使用总数据趋势进行结果分析，得出最佳接种配比为黑曲霉 ∶酿酒酵母 ∶枯草芽孢杆菌=10 ∶10 ∶2，此外除了 2 ∶10 ∶2 接种配比外，其他均达到混料试验的预测结果，完好地验证了混料试验的有效性。最后的验证试验结果表明联合试验设计合理可行。 　　关键词：辣蓼；混料试验；混合发酵；固态发酵；单细胞蛋白；生产工艺 　　中图分类号： S188+.4 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）11-0272-05 　　辣蓼（Polygonum hydropiper Linn.）为一年生草本植物，是中国传统中药材。现代研究表明，辣蓼具有消炎、镇痛和抗氧化等功效[1-2]。传统中药的使用方法常常是热水煎煮法或者直接入药，具有吸收差、有效成分损耗的缺点，而使用现代化的方法（如生物发酵等温和的方式）对辣蓼等传统中药材进行新型研究和开发，将可以很好地弥补这些缺点。 　　随着世界人口的快速增长，世界食物的供需关系会出现严重的不平衡，因此开发一种廉价而又生产速率快的蛋白质食品就显得更加紧迫，而单细胞（single cell protein）由于具有营养丰富、原料广泛廉价和生产速率高等优点，可以很好地解决这个问题。现代单细胞蛋白生产的研究热点是在工农业废物方面，如废弃柠檬果肉和工业废弃甘油等[3-4]，此举不但可以减少环境污染，而且还变废为宝，可以获得营养收益。 　　微生物在自然界的生长是一种天然的多菌混合状态，不同菌株之间促进和拮抗作用并存，最后演变为稳定的微生物群落。而混菌发酵（mixed fermentation）就是模拟这种微生物群落的天然生长状态并加以改良，再综合考虑微生物之间的营养和代谢特性，经过人工仔细挑选之后，削弱菌株之间的拮抗作用，而加强菌株之间的互利作用，从而获得微生物发酵的更大收益。Fang等使用里氏木霉和黑曲霉混合发酵的方式进行纤维素酶生产，在优化了菌种配比和延迟接种之后，获得了最大滤纸酶活（FPA）和非常高的β-葡萄糖苷酶活，是所有试验组中最好的纤维素酶活配比[5]。Li等使用黑曲霉和热带假丝酵母混菌发酵中药水飞蓟工业废弃物来生产饲料添加剂，相比较未发酵物料，粗蛋白含量提升了79.85%，活性成分总黄酮、水飞蓟素分别是未发酵物料的2.42、1.63倍[6]。 　　随着现代研究的发展，试验设计如析因设计、正交试验、Plackett-Burman试验、响应面试验等越来越被研究者所重视。而联合试验设计也因其省时高效的优点受到研究者的青睐，在如今的研究中，Plackett-Burman试验+响应面试验是一种非常常见的试验设计[7-8]，但是广义的联合试验设计远不止如此，根据不同的研究目的，选用不同的联合试验设计，将可以极大地节省试验次数，同时获得很好的试验优化结果。 　　本研究将根据发酵优化的需要，选用混料试验+正交试验的联合试验设计，对辣蓼混菌发酵生产饲料添加剂进行探索，也为广义的联合试验设计起到借鉴作用。 　　1 材料与方法 　　1.1 辣蓼、木薯渣和麦糟 　　辣蓼由广东省农业科学院兽医研究所提供，高速万能粉碎机（FW 100型，天津泰斯特仪器有限公司）磨碎过200目筛，密封袋包装于室温下存放。 　　木薯渣来自于广西武鸣安宁淀粉责任有限公司，50 ℃烘干至恒质量，高速万能粉碎机磨碎过40目筛，-20 ℃储存备用。 　　麦糟来自于广州珠江啤酒集团有限公司，50 ℃烘干至恒质量，高速万能粉碎机磨碎过100目筛，-20 ℃储存备用。 　　1.2 菌种 　　酿酒酵母GIM2.121购买自广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC），作为单细胞蛋白生产菌。 　　黑曲霉GIM3.25购买自广东省微生物菌种保藏中心（GIMCC），分离自酒曲中，具有很强的糖化能力。 　　枯草芽孢?U菌DES-59由华南理工生物科学与工程学院发酵工程研究室保藏，经过紫外和化学联合诱变，高产蛋白酶。 　　黑曲霉-80 ℃甘油孢子悬液保存。取-80 ℃种子，PDA平板划线，30 ℃静止培养5 d；之后取孢子转接至PDA平板