鄄异戊烯基柑橘素促进体外培养成骨细胞成熟矿化的研究.pdf

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 201 1, 38(5): 433~440 8 戊烯基柑橘素促进体外培养成 骨细胞成熟矿化的研究* 明磊国 陈克 ** 葛宝丰 翟远坤 (兰州军区 州总医院骨科研究所，兰州730050) 摘要 研究8- 异戊烯基柑橘素对体外培养大鼠颅骨成骨细胞(rat skull osteoblasts ，ROB)的分化成熟及生物矿化的影响 取新 生大鼠颅骨多次酶消化法得到成骨细胞，培养于含 10% FBS 的MEM 培养液中，3 天后首次换液，待细胞铺满皿底传代培 养 以碱性磷酸酶(alkaline phosphatase ，ALP)为检测指标，96 孔板梯度筛选作用最佳浓度，在最佳浓度作用并成骨性诱导培 养的第3、6、9、12 天测ALP 活性、钙盐沉积量；第 12 天进行ALP 和钙化结节组织化学染色及计数；成骨性诱导后不同 时间点提取Total RNA ，RT real-time PCR 法检测成纤维细胞生长因子(bFGF) 、胰岛素样生长因子- 1(IGF-1)、成骨相关转录 因子Osterix 、Runx-2 和骨形态发生蛋白-2(BMP-2) 的基因表达情况；成骨性诱导的第4 、8、12 天裂解获得细胞总蛋白，蛋 白质印迹法检测人 型胶原蛋白(COL- ) 的蛋白质表达量 研究结果表明：1伊10-6 mol/L 能显著促进成骨细胞的成熟分化， 表现为提高ROB 的ALP 活性、促进钙盐沉 、增加钙化结节数量；提高bFGF、IGF-1、Osterix 、Runx-2 和BMP-2 mRNA -6 表达水平；促进COL- 的合成 由此可知终浓度为 1伊10 mol/L 8- 异戊烯基柑橘素能显著促进ROB 的分化成熟及生物矿 化，证明8- 异戊烯基柑橘素能促进成骨细胞的分化成熟及生物矿化，作为促进骨修复和抗骨质疏松的有效成分具有较大的 药用价值 关键词 骨质疏松，成骨细胞，分化，增殖，8- 异戊烯基柑橘素，矿化 学科分类号 R-332，R-284.1，R-329.24，R-681.053.1 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 10.00495 长期以来，人们发现妇女在采摘啤酒花的过程 验动物中心提供，合格证号SCXK(甘)2004-0006- 中常会发生生理周期紊乱现象，但一直不明原因， 152)；8- 异戊烯基柑橘素(Enzo ，385-025-M005， 近年来才发现其与劳作环境中的雌激素水平有关， USA) ；MEM 培养基、胎牛血清(Gibco 公司) ；胰 是啤酒花中的雌激素样活性成分影响了女性的生理 蛋白酶、 型胶原酶、 - 萘基磷酸钠、地塞米松、 域 琢 周期，其中广泛存在于啤酒花中的8- 异戊烯基 茁- 甘 磷酸钠、磷酸化抗坏血酸、脱脂奶粉、 柑橘素是导致此现象的罪魁祸首 几年来Milligan Gly、Tirs 、BSA(Sigma 公司) ；碱性磷酸酶(ALP)测 [1-3] 等 报道，8- 异戊烯基柑橘素的确具有植物雌激 定试剂盒( 南京建成生物工程研究所)、骨钙素 素样作用，可以作为雌激素的替代品使用 而植物 ELISA 检测试剂盒(ids，UK) ；钙盐沉积量检测试 雌激素作为抗骨质疏松替代疗法的药物被广泛使 剂盒(BioVision，USA) ；RNAiso Reagent 、反转录 用，其效果也已得到临床证实 本文研究了8- 异 试剂盒、Taq DNA 聚合酶，Easy Dilution 稀释液均 戊烯基柑橘素对体外培养成骨细胞分化成熟和生物 由Takara 公司提供；引物由Takara 公司设计合成； 矿化的影响，以探明其是否具有抗骨质疏松活性及 抗体COL- (abcam) ， -actin 、山羊抗鼠辣根标