钙成像在活细胞动态成像中采集条件优化的研究.docVIP

钙成像在活细胞动态成像中采集条件优化的研究 　　摘 要 在活细胞钙成像中，较强的曝光条件会引起胞内钙水平升降，影响实验数据的客观性。为确定最佳活细胞钙成像条件，本实验采用488nm、75mW半导体泵浦固体激光器（DPSSL），在5%～25%激光强度下，通过调节曝光时间和EMCCD灵敏度对Fluo-4标记的293细胞进行成像。通过分析图像对比噪声比（CNR）和胞内钙水平的变化，发现在激光强度5% 、曝光时间100ms条件下获取的影像能较好显示细胞荧光变化，细胞受照剂量较低。 　　关键词 活细胞摄影 钙成像 条件优化 　　钙离子是细胞内重要的第二信使，细胞通过外钙内流和内钙释放参与调节肌肉收缩、神经信号转导、细胞间通讯、细胞分化和凋亡等生命活动[1]。Fluo-4/AM是Fluo-4的一种乙酰甲酯衍生物，能穿透细胞膜进入细胞。AM进入细胞后被胞内酯酶水解，生成的Fluo-4与钙离子结合[2]，在488nm激发光激发下发出绿色荧光，荧光经滤镜过滤反射，最终被EMCCD捕捉。通过测定Fluo-4探针在细胞内的荧光强度变化，可以实时反映细胞内钙离子浓度分布和变化。 　　噪声又称图像斑点，主要由拍摄过程中信号光电转换时电流噪声形成[3]，影响图像细微结构的识别。在激光/EMCCD的成像体系中，图像对比度主要是由激光强度、曝光时间和EMCCD灵敏度决定，对比度越高，得到的影像反差越大、越清晰。图像清晰度是指在一幅影像中反映出捕获微小细节的能力，用对比噪声比（Contrast-to-Noise Ratios，CNR）表示： 　　CNR=（M2-M1）/SD1 　　其中M1代表背景区域荧光灰度密度值，M2代表信号区域荧光灰度密度值，SD1代表背景区域荧光的标准偏差。 　　CNR值越大，图像清晰度越高。 　　在活细胞动态观察中，激光对生物细胞的影响主要表现在光化学效应和热效应[4]。拍摄活细胞图像时，激光光子持续穿过细胞被吸收和衰减，胞内生物分子吸收光子能量，运动加剧，与其他分子碰撞频率增加，产生热能，造成局部温度升高，持续的温度升高可使蛋白丧失活性；另有部分生物分子吸收光子使电子被激发，分子由基态变为激发态，可引起分子中价键结合方式的改变，进而使分子的几何构型、反应活性和机理与基态有较大差别。因此，在满足影像清晰度要求下，应尽可能降低激光强度和曝光时间，从而降低成像造成的细胞损伤。 　　荧光漂白是在激光照射条件下，荧光基团发生化学反应或是构象改变，从而失去发荧光的特性[5]。经过不同条件激光连续照射，Fluo-4标记的荧光会受到不同程度漂白，信号区域荧光强度减弱，进而降低影像的反差和清晰度，因此实验中应避免明显的荧光漂白。活细胞钙成像质量受到上述因素的影响，本实验采用488nm、75mW半导体泵浦固体激光器（DPSSL），在5%～25%激光强度下，通过调节曝光时间和EMCCD灵敏度对Fluo-4标记的293细胞进行成像，对拍摄图像进行对比分析，以确定活细胞钙成像最佳条件。 　　1 材料和方法 　　1.1 材料与仪器 　　人肾细胞系293细胞，UltraVIEW VOX高速碟片式活细胞成像系统（美国PE）， Volocity图像处理系统（美国PE）。 　　1.2 实验方法 　　293细胞制成单细胞悬液，接种于共聚焦小皿中，细胞密度约为104个/cm2，Fluo-4/AM（6μmol/L）37℃孵育30min；将孵育好的293细胞放入UltraVIEW VOX细胞培养小室内，分别按照以下条件扫描成像。 　　1.2.1 固定激光强度为5%，分别选择50ms，100ms，200ms，400ms，800ms曝光时间，固定CCD灵敏度（以最强荧光信号接近饱和不溢出为准），拍摄时间5min，时间间隔为1帧/秒。 　　1.2.2 固定曝光时间为100ms，分别选择5%，10%，15%，20%，25%激光强度，固定CCD灵敏度（以最强荧光信号接近饱和不溢出为准），拍摄时间为5min，时间间隔为1帧/秒。 　　1.2.3 固定激光强度为5%、曝光时间100ms，调节好CCD灵敏度，分别选择拍摄频率为0.5秒/帧，1秒/帧，2秒/帧，3秒/帧，拍摄时间为5min。 　　所得影像选择3个细胞信号区域和一个背景区域（见图1），取信号区域和背景区域的平均荧光灰度密度值及背景区域的荧光灰度密度的标准偏差，计算得出每个时间点的CNR，计算各个拍摄条件下CNR的平均值和标准差。 　　2 结果与讨论 　　2.1 相同激光强度条件下，CNR和曝光时间的关系 　　激光强度5%固定不变时，CNR随曝光时间变化趋势（见图2）。随着曝光时间延长，低剂量时（50～200ms ）CNR有明显升高，此阶段内EMCCD接受光子数远未达到饱和，延长曝光时间