常见的流式细胞仪培训.pptVIP

仪器基本组成 流路 流动室 鞘液SHEATH 样本流SAMPLE 单细胞悬液5?105-1?106个/ml 光路 光源 滤片 光电倍增管PMT HV 电路 放大电路HV及GAIN 增益 A/D转换 统计 计算机 流路 流式细胞仪光路图 细胞凋亡研究 1. 鉴别凋亡与坏死: Annexin Ⅴ/PI 2. 测定凋亡率:Annexin Ⅴ、Apo 2·7、TUNEL 3. 研究凋亡触发机制：Caspase、Fas及FasL bcl-2/bax 4. 多参数分析凋亡是趋势 干细胞能表达ABCG2泵蛋白，在HOECHST 33342染色时能将该染料泵出，因此分析不能被该染料染色的细胞群时可以发现一群不能染色的细胞既是干细胞，因此能够在众多肿瘤细胞中区分出肿瘤干细胞。 肿瘤干细胞中的研究应用-Hoechst 33342 side population Hoechst Hoechst+Vera. Side Population Cells G1 S phase G2 M G1 1 2 1 DNA含量 DNA 含量 细胞周期时相 G0/1 G2/M S 细胞数 细胞周期分析 PI Ethidium Bromide Acridine Orange DAPI (UV excitable) Hoechst 33342 (viable, UV excitable) 不能主动进入细胞，需要固定打孔 488nm激发 为脂溶性，主动进入细胞 UV激发 常用的DNA 染料 DNA含量及细胞周期分析 细胞周期分析:在细胞周期(G0，G1，S，G2 ，M)的各个时期，DNA的含量随各时相呈现出周期性的变化。通过核酸染料标记DNA，并由流式细胞仪进行分析，可以得到细胞各个时期的分布状态，计算出G0/G1%，S%及G2/M%。了解细胞的周期分布及细胞的增殖活性。也可利用细胞周期蛋白（CYCLIN）、Ki67、核增殖抗原（PCNA）等，对细胞周期进行精确的分期：G0、G1、S、G2、M. G0/G1 S G2/M 流式细胞仪分选 电荷式分选是当前的主流分选模式 高速分选是保证结果的基本条件 高纯度和高活性是分选的基本要求 可选的激光要多样化（空冷、水冷、固体；不同的波长；真正的紫外） 提供多种分选流动室 光路稳定，紫外激光功率大 流式分选和磁珠分选的差别和联系 488 nm laser + - Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector 电荷式细胞分选 细胞分选的主要技术指标 分选速度：≧ 25000个细胞/秒 分选纯度：﹥98% 分选后细胞存活率：97% * 主要内容 流式细胞仪概述 流式细胞仪的工作原理 流式细胞仪的应用 检测的一般步骤 一、流式细胞仪概述 流式细胞仪种类 BD FACSVantage BD-Calibur Epics Altra Epics Altra Beckman Coulter 流式细胞仪的定义 流式细胞仪是指，使细胞（或其他粒子）以单个方式依次高速通过激发光束，采集细胞被光照时产生的各种信号，对信号进行处理，并对各参数进行关联分析的一种仪器。 利用流式细胞仪通过检测荧光信号来检测细胞或其它颗粒性物质（表面或胞浆或胞核）的物理、化学特性并通过这些特性对细胞或颗粒进行定量。 检测表面标记物 检测胞浆标记物 检测胞核内标记物 检测可溶性蛋白 流式细胞术 （FLOW CYTOMETRY） 流式细胞仪的基本结构 前向散射 侧向散射 可以揭示细胞内部结构信息 细胞群体特征量分布 样本难以再利用 高速分选 数量少 数量大 静止的细胞样本 流动的细胞 显微镜 流式细胞仪 特殊的显微镜 高速测定细胞，大样本计数 检测稀有细胞 多参数分析 自动化 细胞分选 流式细胞仪的主要特点 二、流式细胞仪工作原理 流式细胞仪工作原理 流式细胞仪通常以激光作为激发光源，经过聚焦整形后的光束垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下产生散射光和激发荧光。这两种信号被光电二极管和光电倍增管接收，之后转换为电信号，再通过模/数转换器，将连续的电信号转换为可被计算机识别的数字信号，最后由计算机进行计算处理。 Injector Tip Fluorescence signals Focused laser beam Sheath fluid 流动室 Air-cooled Argon Ion Laser Beam Shaping Lenses High Sensitivity Quart