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降血脂实验的方法的研究进展 　　【摘要】 根据文献，对近年来国内外降血脂的实验方法作一综述，为降血脂药物的筛选研究提供参考。? 　　【关键词】高脂血症；胆固醇；降血脂；实验方法 　　 　　高脂血症是血脂代谢异常所致。随着人们生活水平的提高，高脂血症成为人类健康“隐形的杀手”，因血脂过高诱发的动脉粥样硬化、冠心病、心肌梗死等心脑血管疾病已成为全球人类健康“第一杀手”[1]。? 　　近年来，降血脂药物的研究备受学术界关注，国内外学者对降血脂药物的作用途径、作用机理及筛选方法进行了广泛探讨。本文简要概述近年来降血脂的实验方法研究进展。? 　　 　　1 体外实验方法? 　　 　　1．1 分子水平 胆固醇是动物机体不可或缺的重要类脂分子，但过多的胆固醇会引起动脉硬化，已成为导致人类心血管疾病的重要因子之一。胆固醇的生物合成可分为3个阶段：甲羟戊酸的合成；鲨烯的合成；27C胆固醇的合成。其中参与第一阶段合成的HMG-CoA还原酶是胆固醇生物合成的限速酶[2]。通过抑制HMG-CoA还原酶的活性，可以减少内源性胆固醇的生成，从而起到降血脂作用。? 　　分光光度法：李鹏等[3]研究了血脂康与洛伐他汀、辛伐他汀对HMG-CoA还原酶抑制作用的比较，从猪肝中提取HMG-CoA还原酶，以NADPH、Cysteamine为底物，HMG-CoA还原酶为催化剂，通过监测由于NADPH的氧化而使340 nm吸收的下降率来测定可溶性酶的活性，测活体系(1 ml)：70 mM磷酸缓冲液，pH 6．5，2 mM EDTA，2 mM Cysteamine，0．06%BSA，0．25 mM NADPH，抑制剂浓度0~200 μg/ml，酶制品50 μL。这种分析方法快速，不必分离底物与产物，以Cysteamine代替昂贵的HMG-CoA可以极大地节约成本。但由于背景反应明显,且有光散射性，故只适用于测定可溶性还原酶活性,而不适用于微粒体。作者认为采用高效液相色谱法在340 nm对NADPH进行分离测定，结果应该更加准确可靠，且成本低，可以大规模筛选，但目前尚未见相关报道。? 　　薄层层析法：胡海峰等[4]建立了体外酶反应系统，以HMG-CoA还原酶抑制剂美伐他汀为阳性对照，使用TLC分析胆固醇合成量的多少，筛选从土壤中分离的真菌次级代谢产物。薄层层析法可有效地将底物与产物分离，是一种常用方法。其它分离方法，如纸层析法和柱层析法，也可达到同样的目的。? 　　同位素掺入法：用鼠肝微粒体或胞浆酶作为粗酶制剂，在反应体系中加入同位素标记的合成前体如［??14?C］-乙酸，或D，L-［??14?C］HMG-CoA，或D，L［?14?C］-甲羟戊酸作为底物，反应后测定形成的固醇中同位素的掺入率，样品抑制固醇脂质合成能力可以通过与对照组数据对比求得[5]。该方法简便，可以省略分离步骤，且灵敏度高，定位定量准确，但对实验人员要求较高。? 　　最近，我国学者发现调控胆固醇代谢新机制：加速胆固醇合成代谢关键酶-羟甲基戊二酰辅酶A还原酶的降解，可以增强细胞对低密度脂蛋白的吸收，降低血液胆固醇水平[6]。这一重要发现为寻找有效的新型降胆固醇药物提供了靶点和理论基础。? 　　1．2 细胞水平 细胞内胆固醇的流出对维持细胞胆固醇平衡、促进胆固醇逆转运及抗动脉粥样硬化都起着非常重要的作用[7]。? 　　张露等[8]研究了银杏叶提取物GBE50对培养细胞内胆固醇代谢的影响，采用胆固醇氧化酶终点法检测GBE50对培养细胞HepG2、HUVEC、SH-SY5Y总胆固醇含量的影响。结果表明，GBE50可有效降低部分培养细胞内总胆固醇的含量。? 　　于碧莲等[9]研究了烟酸对分化成熟的3T3-L1脂肪细胞胆固醇流出的影响，3T3-L1细胞促分化成熟后，给予不同浓度的烟酸干预24 h后，收集细胞，采用液体闪烁计数器检测细胞内胆固醇流出。结果表明，烟酸可加速细胞内胆固醇流出，降低细胞内胆固醇含量。? 　　匡双玉等[10]以血管平滑肌细胞源性荷脂细胞为模型，不同浓度姜黄素作用于细胞24 h及同一浓度姜黄素不同时间作用于细胞，高效液相色谱分析法检测细胞内总胆固醇。结果表明，姜黄素可降低血管平滑肌细胞源性荷脂细胞内总胆固醇、游离胆固醇和胆固醇酯含量，且这种作用跟SREBP-Ⅰ蛋白的表达上调有一定关系。? 　　 　　2 体内实验方法? 　　 　　2．1 高脂乳剂及饲料模型 万丽等[11]研究了脂肪乳剂的最佳配制(配方：20 g 猪油，10 g 胆固醇，1 g 丙硫氧嘧啶，吐温-80 20 ml，丙二醇 20 ml，10%去氧胆酸钠水溶液 20 ml，加蒸馏水至100 ml)，建立小鼠高脂血症模型，用酶比色法测定模型组与正常组血清总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)。结果，模型