冠心病患者中Th17细胞水平的变化及其意义探讨.docVIP

冠心病患者中Th17细胞水平的变化及其意义探讨 　　摘要：目的 探讨不同类型冠状动脉粥样硬化性心脏病患者外周血辅助性T细胞17（T help cell 17，Th17细胞）的变化及其临床意义。方法 选取急性心肌梗死（AMI）患者20例、不稳定性心绞痛（UA）患者25例、稳定性心绞痛（SA）患者19例及健康体检者22例。采用流式细胞仪检测各组患者外周血Th17细胞占CD4+T细胞比例，采用实时定量PCR方法检测IL-17mRNA的表达，采用酶联免疫吸附方法（ ELISA）检测各组患者外周血白细胞介素（IL）-17的表达。结果 AMI组和UA组患者外周血Th17细胞/CD4+T细胞、IL-17mRNA、IL-17表达明显高于SA组和健康对照组（P0.05）。结论 AMI患者和UA患者外周血中Th17细胞比例增加， IL-17mRNA及IL-17水平升高， Th17 细胞可能参与动脉粥样斑块不稳定和冠心病的发病。 　　关键词：冠状动脉粥样硬化性心脏病；辅助性T细胞17；IL-17；IL-17mRNA 　　冠状动脉粥样硬化性心脏病（简称冠心病）是冠状动脉血管发生动脉粥样硬化病变而引起血管腔狭窄或阻塞，造成心肌缺血、缺氧或坏死而导致的心脏病，基本病因是冠状动脉粥样硬化。动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）是动脉血管壁的慢性炎症反应，其中CD4+T淋巴细胞发挥着重要的作用[1]。近年来发现一种新的CD4+T淋巴细胞即Th17细胞，能分泌白介素（Interleukin）-17等多种细胞因子参与炎症过程[2]。许多研究表明Th17细胞及其分泌的细胞因子参与类风湿关节炎、系统性红斑狼疮等多种疾病发病及进展[3-4]。而目前动物实验表明， 在动脉粥样斑块的发生发展中， IL-17参与巨噬细胞的活化并通过相关机制释放蛋白水解因子，IL-17和TNF-α水平的增加能够发挥协同作用创造促炎微环境， 从而促进动脉粥样硬化性疾病的发生发展。由此我们推测 Th17细胞可能通过IL-17的促炎效应，参与并促进粥样斑块不稳定和急性冠状动脉综合征（ACS）的发生发展。本研究通过检测不同类型的冠心病患者外周血Th17细胞、细胞因子IL-17及IL-17mRNA表达水平，分别从细胞水平、分子水平及基因水平进一步探讨Th17细胞在冠心病中的作用。 　　1 资料与方法 　　1.1一般资料 选取2008年10月～2012年10月我院确诊急性心肌梗死（AMI）患者20例，男17例，女3例，年龄（56.8±6.4）岁；不稳定型心绞痛（UA）患者25例，男20例，女5例，年龄（52.9±5.9）岁；稳定型心绞痛（SA）患者19例，男15例，女4例，年龄（55.6±7.2）岁。所有患者均行冠状动脉造影检查。对照组为同期经冠脉造影及临床症状排除冠心病的住院患者22例，男19例，女3例，年龄（53.5±6.8）。排除标准：6个月以内的心肌梗死患者，并发脑卒中、严重的肝肾功能不全者，周围血管疾病或周围血管栓塞性疾病患者，恶性肿瘤患者，自身免疫性疾病、血液系统疾病及服用免疫抑制剂患者。 　　1.2方法 　　1.2.1标本收集 所有受试者及正常对照组在清晨空腹抽取外周静脉血5ml置于肝素抗凝管中，标本室温状态下1000转离心15min，收集上清。分装后-80℃冷冻保存备用。 　　1.2.2人外周血单个核细胞分离及Th17细胞检测 清晨空腹采肘静脉血5ml，肝素钠抗凝， 用PBS等量稀释后采用人淋巴细胞分离液密度梯度离心法获取外周血单个核细胞（PBMC）。用RPMI MEDIUM 1640完全培养液调整细胞浓度为1×106个/ml。取出2×106个细胞，分别加入24孔无菌培养板的2个孔内，每孔1×106个细胞，用RPMI MEDIUM 1640完全培养液定容至1L，每孔各加入2μl PMA（30ng/ml）和10μl Iono（750μg/ml），枪头搅拌混匀，放入37℃ 5%CO2培养箱孵育1h，每孔再各加入1μl高尔基体阻断剂；放入37℃ 5%CO2培养箱孵育4～6h；收集细胞平均分为测定管和同型对照管。加入APC标记的CD4（ebioscience公司）3μl，放入4°冰箱30min。FACS液体2ml洗两遍。加入FIXATION/Permeabilization商品盒（BD公司）250μl，放入4°冰箱30min。加入Permeabilization Buffer液体1ml，1500转/min，8min，离心倒去上清液，洗2遍。分别加入PE标记的IL-17（ebioSCIENCE公司）和同型对照抗体10μl，放入4°冰箱30min。再用Buffer液洗3遍。倒去上清液后加入含1%的PFA固定。流式细胞仪测定Th17细胞比例。 　　1.2.3实时定量P