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转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ定性检测中的问题与策略-农学论文 转基因水稻多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ定性检测中的问题与策略 仇 娟 （湖北省农业科学院粮食作物研究所，武汉 ４３００６４） 摘要：随着转基因水稻研究在世界范围内的研究和开发，以及转基因水稻商业化的争议性加剧，相关部门对粮食安全、食品安全更加关注，农业科研单位检测转基因水稻也将具有重要意义。参照农业部的质检标准书和转基因ＰＣＲ检测中的实践经验，对抗虫转基因水稻在转基因检测中可能出现的问题进行了技术层面和理论层面分析；同时对转基因抗虫水稻的启动子、终止子、内参基因、靶基因等几个元件的检测分别进行探讨，并重点分析了启动子和终止子的检测工作，根据研究者的工作经验报道，从植物病毒学原理和植物基因工程的理论角度，提出了对转基因ＰＣＲ定性检测中可能遇到问题的解决方案。 关键词 ：转基因水稻；定性检测；启动子；终止子；Ｂｔ基因；多重ＰＣＲ；Rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ 中图分类号：Ｑ７８；Ｓ５１１ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）02－0262-04 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.02.002 转基因技术应用于作物以来，转基因产品如玉米、大豆、棉花等都已有商业化的品种问世；目前在世界上使用最多的转基因商业化基因是抗除草剂基因和Ｂｔ杀虫基因。而水稻作为一种主粮，商业化步伐远远慢于这几种作物；目前最有可能商业化的转Ｂｔ杀虫基因的是中国与国际水稻所合作研制的“华恢１号”、“Ｂｔ汕优６３”和欧洲研制的富含维生素Ａ的Ｇｏｌｄｅｎ ｒｉｃｅ［１，２］。 自从国家给转基因水稻发放了安全证书，转基因水稻的商业化成为了热门的议题。目前农业部发放安全证书的转基因水稻有抗虫转基因水稻“华恢１号”和“Ｂｔ汕优６３”，国家制定了关于作物和转基因水稻的检测方法标准［１，３］。国家质量检测部门有完善的种子和食品检测系统，来定性检测是否含有转基因成分。但是随着转基因水稻即将大规模的种植，科研人员在研究和育种过程也有大量的样品需要检测，主要目的有以下几个：①更好地进行常规品种转基因育种工作，防止转基因的品种污染常规品种，保持种质的纯合，同时检测转基因的水稻在田间有没有发生漂移；②节省人力物力，大量的水稻样品送到专门的质检部门检测价格昂贵；③有些检测样品中的转基因成分元件，是超出国家质量标准检测范围的。 转基因作物和转基因食品的检测方法有很多，例如ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Bｌｏｔ、基因芯片等［４－７］。常规和便捷的方法是普通ＰＣＲ以及由其衍生出的半定量ＰＣＲ方法［８，９］；在国内外使用的最多定性作用更强的是Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ［１０－１２］。多重ＰＣＲ检测方法被广泛使用［４］。本文根据自己的一些实践，总结出了在食品检验、科研或者育种工作中进行多重ＰＣＲ检测分析转基因样品中的几个要点。 １ 污染源的杜绝 转基因检测中，只有杜绝一切污染源，才有可能在后续的检测中做出正确的判断。如果没有做好防止污染，很容易出现假阴性和假阳性。因此所有的试剂须新鲜现配、灭菌，枪头、离心管等要严格灭菌，玻璃器皿需要清洗干净［１３］。样品必须防止交叉污染，条件允许的话，可以进口高质量的离心管、枪头等，以便在后续的试验中起到排除污染的作用［１2］。 ２ 样品ＤＮＡ的提取方法 ＤＮＡ的提取方法既可以采用经典的ＣＴＡＢ方法，也可以按照农业部的质检标准书的方法，这两种方法用于ＰＣＲ和半定量ＰＣＲ、Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ荧光定量ＰＣＲ都有很好的结果［３，１４］；条件允许的话，也可以采用试剂盒。有学者采用快速提取法获得的转基因番茄ＤＮＡ，用于Rｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ检测，取得了很好的结果；鉴于这一点，快速方法提取的转基因水稻ＤＮＡ，也应该可以适用于Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的检测，这就为检测大量的水稻ＤＮＡ样品提供了便捷的途径［3，15－17］。Cankar等［18］、Demeke等［19］在水稻转基因检测的实践中，采取适用于ＲＦＬＰ分子标记检测的水稻ＤＮＡ快速提取法，取得了比较好的效果。 ３ 转基因水稻的多重ＰＣＲ检测 根据农业部的质检标准书，采用的是多重ＰＣＲ和Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ ＰＣＲ的方法。在转基因的检测中，有4个检测元件：启动子、终止子、靶基因、内参基因。转基因的定性检测中，首先要检测的是内参基因，因为内参基因能确定ＤＮＡ模板的质量；然后是检测启动子和终止子，在检测出启动子或者终止子以后，还要进一步检测靶基因。只有两个以上的转基因元件被检测出，才能定性为转基因的水稻［３，４，９，２０］。 ３．１ 内参基因的检测 在定性检测转基因水