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诺沃霉素植生链霉菌发酵培养基的优化-农学论文 诺沃霉素植生链霉菌发酵培养基的优化 丁璟剑，万中义，方 伟，彭冬麟 （湖北省生物农药工程研究中心／湖北省农业科技创新中心生物农药研究分中心，武汉 ４３００６４） 摘要：通过优化发酵培养基中的成分及其含量，提高诺沃霉素有效组分的产量。以高效液相色谱检测目标产物的峰面积作为指标，通过单因素试验获得最佳碳源及氮源。使用正交试验等获得最佳发酵培养基：葡萄糖４.0％，酵母浸粉０．５％，豆粕１.0％，磷酸氢二钾０．０３５％，碳酸钙０．０５％，豆油０．１％。相关发酵条件为ｐＨ ７．０，种龄９６ ｈ，接种量１０％，发酵温度２８ ℃，发酵时间１２０ ｈ。根据高效液相色谱检测结果，在最佳发酵条件下，目标产物产量比对照培养基提高了657％。 关键词 ：培养基优化；正交试验；诺沃霉素；发酵条件 中图分类号：Ｑ９３９．９ 文献标识码：A 文章编号：0439－８114（２０15）16－3928-04 DOI:10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2015.16.024 收稿日期：２０１５－０４－１５ 基金项目：湖北省农业科技创新中心资助项目（２０１４－６２０－００８－００１）；湖北省农业科学院竞争性计划项目（２０１４ｊｚｘｊｈ０４） 作者简介：丁璟剑（１９９０－），男，湖北武汉人，学士，主要从事生物农药发酵工艺研究，（电话）１３５４５１７１７６７（电子信箱）ｄｊｊｇｏ１９９０＠１６３．ｃｏｍ； 通信作者，万中义，研究员，博士，主要从事农用抗生素研究，（电话）１３９７１０６２１７６（电子信箱）ｗａｎｚｈｏｎｇｙｉ１９６４＠１２６．ｃｏｍ。 随着化学农药的长期大量使用，各种问题逐渐暴露出来，如利用率低、难降解、污染范围广、选择性不高、害虫产生抗药性、危害人类健康等。因此，生物农药逐渐受到人们的重视［１］。相对于化学农药而言，生物农药具有选择性高、环境相容性好、对天敌较安全、不容易产生抗性、生产工艺比较简单等优点［２］。 根据来源，生物农药可分为植物源、微生物源等，农用抗生素是源于微生物的一类具有明确化学结构、明确活性的天然产物［３］。在中国农用抗生素属于生物化学农药，它具有生物农药环境相容性好的优点，也有化学农药活性明确、使用效果好的优点，因而是现在和将来最受欢迎的生物农药种类。 诺沃霉素（Ｎｏｖｏｎｅｓｔｍｙｃｉｎ）是湖北省生物农药工程研究中心在世界上首次发现的一种新的３２元大环内酯类抗生素［４］，具有广谱抗真菌活性。该抗生素对很多植物病原真菌如黄瓜棒孢菌、芒果褐斑病菌、立枯丝核菌等具有很强的活性，活性强度（最低抑菌浓度ＭＩＣ）超过多烯类抗生素、放线菌酮，具有良好的应用开发前景。提高产生菌发酵水平，对于其工业化生产是十分重要的。试验着重研究其摇瓶培养基的优化。 培养基是用来供抗生素产生菌生长、繁殖、代谢合成抗生素的，是按一定比例组成的营养物质。培养基的成分和配比合适与否，对产生菌的生长、发育、次级代谢产物的合成有很大的影响，同时还会影响到提取工艺、产品质量及成本［５］。因此根据菌种特点探索出最适合其生长、并有较高目标产物产量的培养基是发酵技术最重要的一环，同时也为将来的工业化生产做准备。 １ 材料与方法 １．１ 材料 １．１．１ 菌种 植生链霉菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｐｈｙｔｏｈａｂｉｔａｎｓ）ＨＢＥＲＣ－２０８２１，由湖北省生物农药工程研究中心分离保存。 １．１．２ 培养基 斜面培养基：ＩＳＰ－２培养基。采用１８ ｍｍ×１８０ ｍｍ玻璃试管，每管装琼脂培养基８～１０ ｍＬ。 种子培养基（ｇ／Ｌ）：甘露醇２０；大豆蛋白胨１０；磷酸氢二钾０．３５；碳酸钙０．５；豆油１； ｐＨ ７．０。采用５００ ｍＬ带档板三角瓶，每瓶装培养基１００ ｍＬ，１２１ ℃灭菌３０ ｍｉｎ。 对照发酵培养基（ｇ／Ｌ）：同种子培养基。 １．１．３ 试验仪器 大振幅摇床ＳＰＨ－３２２２（上海世平实验设备有限公司）；高速离心机ＧＬ２１Ｍ（长沙湘智离心机仪器有限公司）；Ｗａｔｅｒｓ ２６９５高效液相色谱仪（Ｗａｔｅｒｓ ２９９６二极管阵列式检测器）；自动发酵罐ＢＩＯＴＥＣＨ－２０－２００ＪＳ（上海保兴生物设备工程有限公司）；天平ＪＹ６００２电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；旋转蒸发仪ＲＥ－２０００（上海亚荣生化仪器厂）。 １．２ 试验方法 １．２．１ 菌株的摇瓶发酵 在无菌条件下，从斜面取８～１０ ｍｍ的菌饼转移至种子摇瓶中，在２８ ℃，１５０ ｒ／ｍｉｎ旋转式摇床上，振荡培养９６ ｈ，然后按１０％（Ｖ／Ｖ）的接种量转接至发酵培养基中，将培养基置于２８ ℃、１５