高盐的方法提取蒙古黄芪基因组DNA比较分析.docVIP

高盐的方法提取蒙古黄芪基因组DNA比较分析 　　摘要：为了提取高质量的蒙古黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）基因组ＤＮＡ，采用高盐十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）法、高盐溴化十六烷基三甲基溴化铵（ＣＴＡＢ）法和高盐低ｐＨ值法，结果表明高盐ＣＴＡＢ法获得的黄芪基因组ＤＮＡ纯度高，能用于ＰＣＲ扩增和限制性内切酶酶切，是提取黄芪基因组总ＤＮＡ的最佳方法。 　　关键词：高盐；蒙古黄芪；ＤＮＡ提取 　　中图分类号：Ｒ２８２；Ｑ５０３文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）03－0595-04 　　 　　Ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ mｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ 　　 　　ＨＡＮ Ｙａ－ｎａｎ，ＺＨＡＯ Ｘｉｕ－ｊｕａｎ，ＬＩ Ｙａｎ－ｊｕｎ，ＣＡＩ Ｌｕ 　　（Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｍａｔｈｅｍａｔｉｃｓ Ｐｈｙｓｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｉｎｎｅｒ Ｍｏｎｇｏｌｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｂａｏｔｏｕ ０１４０１０，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＳＤＳ， ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ， ａｎｄ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ｌｏｗ ｐＨ ｖａｌｕｅ ｍｅｔｈｏｄｓ ｗｅｒｅ ｕｓｅｄ ｔｏ ｅｘｔｒａｃｔ ｈｉｇｈ ｑｕａｌｉｔｙ Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ． Ｔｈｅ ｒｅｓｕｌｔｓ ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｈｉｇｈｅｓｔ ｑｕａｌｉｔｙ ｗａｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｍｅｔｈｏｄ， ａｎｄ ｗａｓ ｐｒｅｆｅｒａｂｌｅ ｅｎｏｕｇｈ ｔｏ ｂｅ ｕｓｅｄ ａｓ ＰＣＲ ｔｅｍｐｌａｔｅ ａｎｄ ｄｉｇｅｓｔｅｄ ｂｙ ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ ｅｎｚｙｍｅ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ； ｔｈｕｓ ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ ＣＴＡＢ ｗａｓ ｔｈｅ ｂｅｓｔ ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： ｈｉｇｈ－ｓａｌｔ； Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ； ＤＮＡ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ 　　 　　蒙古黄芪（Ａｓｔｒａｇａｌｕｓ ｍｅｍｂｒａｎａｃｅｕｓ）属双子叶植物纲豆科植物，分布于黑龙江、吉林、内蒙古、河北、山西等地，可以补气固表、托毒生肌、利水退肿。治气短心悸、乏力、虚脱、自汗、盗汗、体虚浮肿、慢性肾炎、久泻等疾病［１］。近年来由于环境的恶化、土地盐碱化愈加严重，蒙古黄芪资源逐渐匮乏。因此，高盐环境下蒙古黄芪的生理生化特性及分子生物学研究就变得尤为重要，而进行这些研究的必要前提就是提取高质量的蒙古黄芪基因组ＤＮＡ。提取植物基因组ＤＮＡ的方法有很多，其中高盐提取基因组ＤＮＡ方法的优点是可以将ＤＮＡ与蛋白质、多糖充分分离，对提取含有大量次生代谢产物物种的ＤＮＡ是较为理想的方法［2］。据此，本实验选用了３种高盐方法，即高盐ＳＤＳ法［３］、高盐ＣＴＡＢ法［４］和高盐低ｐＨ值法［５］，比较３种方法的提取效果，以找到黄芪基因组ＤＮＡ的最佳提取方法，为进一步分子生物学研究奠定基础。 　　１材料与方法 　　１．１材料 　　本实验采用种植了两周的蒙古黄芪叶片作为研究对象，蒙古黄芪种子购于内蒙古赤峰市喀喇沁旗牛家营子镇中药材基地。 　　１．２仪器 　　水浴恒温摇床（ＺＨＷＹ－１１０Ｘ３０），台式多功能高速离心机（Ｃｅｎｔｒｉｆｕｇｅ ５８０４Ｒ），紫外分光光度计（ＮＤ－１０００ Ｓｐｅｃｔｒｏｐｈｏｔｏｍｅｔｅｒ），凝胶成像仪（ＧｅｎＧｅｎｉｕｓ），基因扩增仪（Ｂｉｏｍｅｔｒａ Ｔ１）。 　　１．３无菌苗的种植 　　１．３．１种子预处理挑选饱满的黄芪种子，用研钵研成粉末，研磨过程中加入少许沙粒，用７５％的乙醇浸泡３０ ｓ，０．１％升汞浸泡５ ｍｉｎ，无菌水冲洗３次，最后用无菌水３７℃浸泡３ ｈ［６］。 　　１．３．２培养基母液配制大量元素１ ０００ ｍＬ，含硝酸钾１９．０ ｇ、 氯化铵２２．２ ｇ、 ＭｇＳＯ４?７Ｈ２Ｏ ３．７ ｇ、磷酸二氢钾１．７ ｇ、 无水ＣａＣｌ２ ３．３ ｇ。有机成分２００ ｍＬ，含肌醇２．０ ｇ、 盐酸硫胺（ＶＢ１）０．００２ ｇ、 盐酸吡哆 　　锌（ＶＢ６）０．０１ ｇ、 烟酸０．０１ ｇ、 甘氨酸０．０４ ｇ。螯合铁２００ ｍＬ， 含ＦｅＳＯ４?７Ｈ２Ｏ １．１１ ｇ、 乙二胺四乙酸 　　二钠１．５ ｇ。微量元素２００ ｍＬ，含ＭｎＳＯ４?Ｈ２Ｏ