新城疫病毒中强毒株检测方法荧光RT-PCR法.PDFVIP

新城疫病毒中强毒株检测方法 荧光 RT-PCR 法 SN/T 1686-2005 1 范围 本标准规定了新城疫中强毒株 TaqMan 实时荧光 RT-PCR 检测方法。 本标准适用于禽类及其产品新城疫病毒中强毒株的检测。 2 规范性引用文件 下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引 用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准， 然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡 是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。 GB/T 19438.1-2004 禽流感病毒通用荧光 RT-PCR 检测方法 3 缩略语 下列缩略语适用于本标准。 3.1 荧光 RT-PCR 荧光反转录-聚合酶链反应。 3.2 Ct 值 每个反应管内的荧光信号量达到设定的阈值时所经历的循环圈数。 3.3 RNA 核糖核酸 3.4 Taq 酶 Taq RNA 聚合酶 3.5 PBS 磷酸盐缓冲生理盐水 3.6 DEPC 焦碳酸乙二酯。 4 原理 采用 TaqMan 方法，在比对新城病毒 F 基因序列的基础上，设计针对 F 基因的特异性引物和特异性的荧光双标记探针进行配对。探针 5’端标记 FAM 荧 光素为报告荧光基团（用 R 表示），3’端标记 TAMPA 荧光素为淬灭荧光基团（用 Q 表示），它在近距离内能吸收 5’端荧光基团发出的荧光信号。PCR 反应进入 退火阶段时，引物和探针同时与目的基因片段结合，此时探针上 R 基团发出的 1 荧光信号被 Q 基团所吸收，仪器检测不到荧光信号；而反应进行到延伸阶段时， Taq 酶的 5’→3’的外切核酸酶功能将探针降解。这样探针上的R 基团游离出来， 所发出的荧光不再为 Q 所吸收而被检测仪所接收。随着 PCR 反应的循环进行， PCR 产物与荧光信号的增长呈现对应关系。 5 检测实验室的设备与管理 中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR 检测实验室的标准化设置与管理见 GB/T 19438.1-2004 附录 C 。 6 试剂和仪器 6.1 试剂 除另有说明，所有试剂均为分析纯；所有试剂均无 RNA 酶的容器分装。 6.1.1 三氯甲烷。 6.1.2 异丙醇：-20℃预冷。 6.1.3 75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC 水（符合 GB 6682 要求）配制， -20℃预冷。 6.1.4 0.01mol/L(pH7.2)的PBS ：配方见附录A 。（121±2 ）℃，15min高压灭菌 冷却后，无菌条件下加入青霉素、链毒素各10000IU/ML。 6.1.5 中强毒株新城疫病毒荧光RT-PCR 检测试剂盒：试剂盒的组成、说明及使 用注意事项参见附录 B 。 6.2 仪器设备 6.2.1 高速台式离心机：最大离心力 12000r/min 以上。 6.2.2 荧光 PCR 检测仪、计算机。 6.2.3 2℃-8℃冰箱和-20℃冰箱。 6.2.4 微量移液器：0.5ul-10ul, 5ul-20ul, 20ul-200ul, 200ul-1000ul 。 6.2.5 组织匀浆器。 6.2.6 混匀器。 7 样品的采集与前处理 采样过程中样本不得交叉污染，采样及样品前处理过程中须戴一次性手套。 7.1 取样工具 7.1.1 棉拭子、剪刀、镊子、研钵、Eppendort 管。 2 7.1.2 所有上述取样工具必须经（121±2）℃，15min高压灭菌并烘干或经160 ℃干烤2h。 7.2 采样方法 7.2.1 活禽样品 7.2.1.1 咽喉拭子采样，采样时要将拭子深入喉头上腭及上腭裂来回刮3次-5 次，取咽喉分泌液。 7.2.1.2 泄殖腔棉拭子采样，将拭子深入泄殖腔转一圈沾取粪便。 7.