唯尚立德内部资料-TALEN CRISPR培训.docVIP

北京唯尚立德生物科技有限公司 划时代的靶向基因操作技术 -TALEN和CRISPR/Cas9 北京唯尚立德生物科技有限公司 唯尚立德 客户为天 沟通迅捷 服务周全 您的满意 我的心愿 生物学家的梦想： 随心所欲地操作基因 无论研究什么生物现象， 都需要做一件事：改变基因 1） Loss function：降低基因或删除基因 2) Give function: 提高基因的表达 在逻辑上，从必要性和充分性方面阐明基因功能 生物学家的梦想： 随心所欲地操作基因 经典基因操作： 1. Gene trap: 化学诱变； 转座子--------海量的筛选+good Luck 2. 同源重组：一般物种几率低, 10-6 ； ES cell 10-2 难！ 突破性的发现： RNAi-Knockdown; 不完全敲除，临时性 充满梦想却幻灭的ZFN： ? 难以完全找到匹配的3连子锌指； ? Off-target 严重 美国加州大学Dave Segal教授说： “ With zinc fingers, we have to let the DNA tell us where we target” 完美基因靶向操作： 识别特异DNA序列的蛋白+操作DNA的酶 划时代的基因靶向操作技术： TALE与 CRISPR/Cas9使靶向操作不再是梦 我们不再大海捞针！！！ 北京唯尚立德生物科技有限公司 TALE 和 CRISPR 的原理 TALE的密码和原理 RVD: 12, 13, repeat-variable diresidues HD:C NG:T NI:A NN:G/A 中心法则密码的延伸： DNA Protein Boch al. Science.2009 Boch J. and Bonas U., 2010 RNA TALE的结构 Dong Deng et al., Science 5 January 2012 ,121:5670 TALE的主要两个应用 1. TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases ） 识别任意特定核酸靶序列的 重组核酸酶 2. TALEA （transcription activator-like (TAL) effector activator） 或TALE-TF 激活体内任意目标基因的转 录激活因子 TALEN-神奇的基因剪刀 TALEN两部分组成：识别特异DNA序列的TALE和内切酶FOKI 有了TALEN, 想在哪里剪断DNA就在哪里剪。 TALEN 的高特异性 Cat基因的TALEN与靶点: TALEN Cat-L1: T GCCTAACCAATGGAGC AAACAATGTATAGTGTC TAG ATGGCTTTGGAAAGCA A Cat-L2: T AACCAATGGAGCAAAC A ATGTATAGTGTC TAG ATGGCTTTGGAAAGCA A 报道质粒靶点DNA序列 LUC-WT reporter :TTGCCTAACCAATGGAGCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCT T TGGAAAGCAAT LUC-Mu reporter: TTGCCTAACCAATGGACCAAACAATGTATAGTGTCTAGATGGCT T TGGAAAGCAAT 40 45 A L E 活 性 40 35 30 25 20 15 10 5 1 35.6 18.3 T A L E N 活 性 35 30 25 20 15 10 5 28.5 T N 12.2 1 0 0 NC LUC-Wt LUC-Mu NC Cat-L2(LUC-Wt) Cat-L2(LUC-Mu) TALEN Cat-L1 对 WT and Mutant DNA 剪切活性 TALEN Cat-L2 对 WT and Mutant DNA 剪切活性 CRISPR/Cas9 System Clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/Cas9是细菌 和古细菌一种不断进化适应的免疫防御机制。 CRISPR/Cas9利用一段小 RNA 来识别并进行 有效的靶向DNA剪切。 ? A Programmable Dual-RNA–Guided DNA Endonuclease in Adaptive Bacterial Immunity – Science, 2012, 337:816-821 ? RNA-Guided Human Genome Engineering via Cas9 – Science, 2013, online ? Multiplex