石蜡包埋组织DNA提取及其应用.DOCVIP

石蜡包埋组织的DNA提取及其应用 近10年来，现代分子生物学技术越来越广泛地被用于人类疾病研究的诸领域，为了解病理状态下基因组DNA的变化积累了新资料。目前认为，人类基因组并非人们想像的那样稳定，诸如基因重排、扩增、缺失，突变和DNA甲基化类型改变等时有发生，这些改变对于基因表达和调控，以及疾病过程的发展与转归等方面均具有重要意义。 　　医院病理科档案中积存的大量石蜡包埋组织，是一个可靠的分子生物学研究的材料来源。在石蜡切片上进行原位杂交或原位PCR分析的分子生物学方法，是免疫细胞化学技术的重要延伸。通过对DNA或mRNA分析亦可直接证实或补充免疫细胞化学的发现。这些对形态学家较为熟悉的原位分子生物学技术，本节　不再赘述。Goelz(1985)和Dubeau 等（1986）成功地从蜡块中提取出高质量的DNA，完全可以满足某些肿瘤分子生物学研究的需要，结束了DNA研究依赖于新鲜或冰冻组织和细胞的历史，而且可以广泛地应用于大宗病例的回顾性研究，对肿瘤发生的分子机制的探讨，诊断与鉴别诊断研究和患者预后评估等方面均具有重要价值。本节　重点讨论石蜡包埋组织DNA提取的方法学及其潜在的应用前景。 　　一、石蜡包埋组织DNA提取的基本方法 　　从石蜡包埋组织中提取DNA的基本步骤，是在常规DNA提取方法的基础上改良和演变而来。Goelz等（1985）最先提出的石蜡包埋组织DNA提取技术（表18-5），是用机械的方法破碎组织，切除多余的石蜡，直接进入含SDS和高浓度蛋白酶K（1mg/ml）的提取缓冲液加温孵育，然后进行苯酚和氯仿抽提。所得DNA虽不完整，但可被限制性内切酶切割，因而适于点杂交，印迹杂交等多种分子生物学实验。Dubeau等（1986）在上述方法上作了改进。首先通过组织切片用二甲苯脱蜡，保证了组织的完全破碎，使细胞与消化液充分接触，使DNA释放和蛋白去除更加完全；其次通过两步消化的方法，将不适于做分子杂交的降解的DNA小片段去除，仅保留那些可螺旋化的完整的DNA大分子，从而提高了DNA质量，适于做Southern印迹杂交分析。Moerkerk等（1990）对上述两种方法进行了比较，发现两种方法所取得DNA之点杂交结果一致，非螺旋化DNA亦不影响杂交分析。 表18-5 Gpelz氏DNA提取方法的主要步骤 1．切除多余石蜡，暴露组织 2．将组织切碎（最大径0.5mm），称重； 3．溶于TE9提取液（组织50mg/5ml,50～500mg/10ml）,高速混悬2～3min；于48℃放置24h，其制备见表18-6； 4．再次混悬组织，加入蛋白酶K至终浓度1mg/ml,SDS至2%，孵育40h； 5．用等体积酚-氯仿溶液抽提3次； 6．2.5倍体积乙醇沉淀DNA 7．-70℃放置2～4h 8．9000×g离心1h 9．沉淀物用70%乙醇洗1次 10．干燥，TE（pH7.2）溶解。 表18-6 TE9 DNA提取液的制备 500mmol/L Tris 20mmol/L EDTA 10mmoo/L NaCl 1% SDS 500μg/ml 蛋白酶K 　 PH8.0 5μm组织切片 ↓ 常规脱蜡、水化 ↓ 第一次溶液A孵育（去上清） ↓ 第二次溶液A孵育（留上清） ↓ 氯仿-异戊醇抽提 ↓ RNA酶和蛋白酶消化 ↓ 酚抽提 ↓ 沉淀 ↓ （却除未螺旋化DNA）↓ 透析 图18-6　石蜡包埋组织DNA提取流程（Drbeau等，1986） 溶液A 2×SSC 100μg 蛋白酶K/ml 1% SDS 　　不同类型的基因分析所要求的DNA质量长数量不同。Southern印迹杂交分析需要10～15μg大片段DNA（＞20kb），因为杂交前要进行相应的限制性内切酶消化和凝胶分离不同片段长度的DNA。故DNA提取要求高，小片段DNA存在会直接影响杂交信号。与之相反，多聚酶链反应（PCR）则可在相对粗制的小片段DNA样本上进行，分析所需的DNA很少，0.5μg甚至更少即可。PCR的模板DNA制备方法很多，除上述两种方法外，还有更简便的直接水煮法（Sle－bos,et al, 1990；Smit, et al. 1988）、蛋白酶消化法（Impraim et al. 1987；Brice, et al. 1989）。这些方法不经过酚-氯仿-异戊醇抽提、DNA纯化等步骤，直接将组织放在去离子水中煮沸10min或在蛋白酶K缓冲液中消化4h，DNA即可释放出来。此提取物可直接用作模板，进行PCR扩增，但是，我们发现直接水煮法和蛋白酶消化法提取的DNA，扩增率较低，且重复性不好。这可能是由于DNA附着的蛋白质去除不净而影响DNA变性和引物的结合，亦可能是由于标本中残留的固定剂等成分对Taq DNA多聚酶的抑制所致。 　　二、影响DNA提取质量的因素 　　1．固定剂