Western-blotting蛋白免疫印迹实验学习资料.pptVIP

放射自显影 原理：利用放射性核素发射的射线，使感光材料中的卤化银等感光，显出影像后进行放射性标记物的定位和定量测量的技术。 特点：灵敏度高、分辨率好、保存时间长久，但由于实验所用方式性物质对人体有辐射作用。 应用：多用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 底物化学发光ECL 原理:化学发光是在一些特殊的化学反应中吸收了反应释放的化学能,而处于电子激发态的反应中间体或反应产物由激发态回到基态时所产生的一种光辐射,化学发光分析是根据化学反应产物的光辐射(化学发光)确定物质含量的一种痕量分析方法。 特点:灵敏度高和线性范围宽，不需要任何光源。 底物荧光ECF 原理：是利用的荧光染料（如Cy2 ,Cy3, Cy5）标记二抗，标记荧光染料的二抗分别对应相应的目的蛋白，以此实现通过检测荧光染料的信号强度，实现种蛋白信号的检测，以进行精确的定量分析。 荧光检测Western Blot本来不是检测的主流方法，不过荧光法检测允许在同一张转印膜上用不同颜色的荧光底物同时检测不同的目标。 底物DAB呈色 原理：二氨基联苯胺（Diaminobenzidine,DAB）是辣根过氧化物酶最敏感、最常用的显色底物，反应产物因不溶于水、二甲苯和醇的棕色沉淀物而被广泛地用于蛋白印迹（Western Blot,WB)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)、斑点印迹(Dot blot)和生物芯片(Biochip)等的染色和显色反应。用之进行对底物显色即被称为底物DAB呈色法。 此技术成本低，操作也较简单是常用的western blot成像分析技术之一，不过由于其灵敏度稍低，在目的蛋白表达量较少的情况下可能没有理想的结果应慎用。 3.1.8 显影检测 弃二抗溶液，用TBST洗膜3次（置于振荡培养箱中，26℃， 80rpm/min, 10min/每次）； ECL工作液的配制：等体积混合Detection reagent 1和Detection reagent 2，现配现用。 根据膜的大小，按每10平方厘米膜加1mL ECL工作液，滴加ECL工作液工作液到膜上，确保使工作液均匀覆盖在膜上，放置1分钟。 利用化学发光系统采集图像和进行图像分析。 * 3.2 结果分析 * 3.3 注意事项 * 电泳结束后，应及时用清洗干净玻璃板，清洗时应使用海绵擦布，切勿使用刷子，以免刮花玻璃板；并及时冲洗电泳槽，以免盐离子沉积，导致电泳丝腐蚀； 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的叠放位置，以保证正确的转印方向； 注意海绵垫，滤纸（转膜专用滤纸），转印膜，胶的相对大小，以免造成短路； 转印结束后，应及时取出转印膜，并立即用TBST漂洗1-2遍，并立即加入封闭液，这样可以避免膜上的杂质残留或膜变干导致背景高的问题； 1.1 蛋白免疫印迹的概念 是将电泳分离后的总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术。 * 1.2 蛋白免疫印迹的应用 基因在蛋白水平的表达研究 例： 吴德平,王颖等.立氏立克次体蛋白抗原基因的表达和重组蛋白抗原 的免疫印迹分析[J].中国人兽共患病学报,2009,25(10):931-934. 抗体活性检测 例：胡纪文，马东礼.免疫印迹法检测血清幽门螺杆菌抗体的应用价值[J]. 热带医学杂志,2013,13(8):952-956. 疾病早期诊断 例：诸延慧，容瓘等.酶联免疫印迹术(EITB)在小鼠日本血吸虫感染早期 诊断中的应用[J]. 中国人兽共患病杂志,1993,9(3):26-29. * 1.2 蛋白免疫印迹的应用 检测样品中特异性蛋白质是否存在 例：李桂波.利用免疫印迹法钓取PC3M细胞中与人前列腺癌高转移 相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007. 对特异性蛋白质进行半定量分析 例： * 1.3 WB的原理 WB采用的是聚丙烯酰氨凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的蛋白质进行着色。 通过分析着色的位置和着色的深度获得特定的蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。 * 1.4 WB的特点 WB是在蛋白质电泳分离和抗原、抗体检测基础上发展起来的检测蛋白质的技术 SDS凝胶电泳：高分辨率 抗原抗体反应：特异性 转膜：灵敏度 * 目 录 * 1.试剂 2.耗材 3.设备 WB的基础 一 实验步骤与结果分析 三 实验室常见问题解答 四