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南疆鸡群感染H9N2亚型AIV诊断剖析 　　摘要：为了证实南疆鸡群感染了H9N2亚型AIV，对2个鸡场6份疑似H9N2亚型AIV感染病鸡组织病料，进行H9N2亚型AIV HA和NA基因部分片段扩增、测序及序列分析。结果表明，南疆该鸡场感染了H9N2亚型AIV。因此，南疆地区养殖场应重视该病的预防和控制。 　　关键词：南疆；禽流感；H9N2亚型 　　中图分类号： S858.31 文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0303-03 　　收稿日期：2014-11-03 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；华中农业大学塔里木大学科研联合基金（编号：HNTDLH1404）；新疆生产建设兵团塔里木畜牧科技重点实验室开放课题（编号：HS2014011）；新疆生产建设兵团博士资金（编号：2012BB023）；塔里木大学高教研究项目（编号：TDGJ1409）；国家大学生创新创业训练计划（编号：20140757023）。 　　作者简介：刘永宏，男，内蒙古呼和浩特人，博士，研究方向为传染病与免疫病理学。E-mail： lyhdky@126.com。 　　通信作者：赵丽。流感病毒（influenza virus，IV）是正黏病毒科流感病毒属成员，根据病毒粒子中NP和M蛋白的抗原差异，分为甲（A）、乙（B）和丙（C）3型，其中A型流感病毒的抗原变异性最强，常引起世界性大流行。A型流感病毒基因组为8个分节段负链RNA，编码12～13种病毒蛋白。A型流感病毒根据2种表面蛋白血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）的抗原性特点分为不同的亚型，已证明有16个HA亚型和9个NA亚型[1-5]。HA和NA基因可作为RT-PCR方法的靶序列基因，用于AIV的亚型鉴别。 　　1966年Homme等分离到第1株H9N2亚型AIV[6]，此后H9N2亚型AIV在世界各地广泛流行。1988年，香港在亚洲范围内第1次从陆禽中分离到3株H9N2亚型AIV[7]。1994年陈伯伦等分离到中国第1株H9N2亚型AIV[8]，后来发现H9N2亚型AIV在我国各地普遍存在，2009年新疆报道从野生灰雁中分离到H9N2亚型AIV[9]，新疆也报道了个体养殖户麻花鸡感染H9亚型AIV[10]。H9N2亚型AI多呈低致病性感染，但由于分布广泛且呈蔓延之势，有重组为强毒的可能性，因此给养禽业造成的威胁不容忽视。本研究对南疆发病疑似H9N2亚型AIV感染鸡组织病料，进行RT-PCR扩增HA和NA基因部分片段，并测序确定其亚型。 　　1材料与方法 　　1.1材料 　　1.1.1病料6份病鸡组织病料，来自2013年南疆地区2个鸡场，-20 ℃保存备用。 　　1.1.2主要试剂Trizol invitrogenTM（编码.：15596-026），购自Invitrogen生物工程有限公司；TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0（编码.：DRR019A），Premix Taq Version2.0（编码.：D331A）和DNA Marker 2000，购自宝生物工程（大连）有限公司；TIANgel Midi Purification Kit（编码.：DP209），购自天根生化科技（北京）有限公司等。 　　1.1.3引物按照引物设计原则，利用Primer Premier 5.0分子生物学软件，以GenBank数据库中国内外已发表的H9N2亚型AIV的HA和NA基因全序列为参照设计特异性引物。引物序列为HA：5′-TGCAACAAATCTGGGACA-3′，5′-AGGCGACAGTCGAATAAA-3′；NA：5′-TTGCGACAA-TATGTTTCC-3′，5′-GCTATTTGAAGTCCACCAC-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成，预期大小约为 1 420、1 270 bp。 　　1.1.4仪器PCR仪：TC-5000，比比科技有限公司；小型高速冷冻离心机：R134a，密封式制冷系统；电泳仪：DYY-12，北京市六一仪器厂；紫外分析仪：JY02S，北京君意东方电泳仪设备有限公司等。 　　1.2方法 　　1.2.1总RNA提取从病鸡组织病料中提取总RNA，按Trizol invitrogenTM试剂盒说明书操作。 　　1.2.2RT-PCR反应总RNA按照TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver.3.0试剂盒，利用已设计的特异性引物，进行一步法扩增HA或NA基因片段，退火温度均为51 ℃。cDNA同时加HA和NA特异性引物，作为阴性对照。 　　1.2.3PCR产物纯化回收取HA或NA基因片段RT-PCR扩增产物电泳切胶后，