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基因工程专题疑难问题分析 　　这两年在讲授人教版选修3《现代生物科技专题》的“基因工程”专题部分时，发现无论是部分老师，还是学生对其中的有关问题，都存在着或多或少的疑问，现收集教学一线碰到的以下问题逐一进行解析，供同行参考。 　　问题1：在现代生物技术应用中，利用最多的就是在细菌细胞中生产真核蛋白，比如人胰岛素和生长激素。但是，真核基因的核基因序列却很少直接用来做表达蛋白质的工作，这是为什么? 　　 　　解析：在细菌等原核细胞中，结构基因通常指一个DNA片段，它可以转录产生mRNA分子。mRNA分子通过翻译合成细胞中所需的蛋白质(图1)。在真核细胞中，基因的结构相对要复杂一些(图2)。真核基因的编码区域(外显子)往往被一些非编码区域(内含子)所分开，因此，在一个完整的真核基因转录以后，内含子要被剪切删除掉，再把外显子连起来，这个过程称为剪切，属于转录后加工。剪切之后就能产生有功能的mRNA。遗憾的是细菌无法有效地去除内含子，剪切连接外显子。因此，真核基因的核基因序列很少直接用来做表达蛋白质的工作。 　　人们一般都愿意把真核细胞的mRNA反转录成双链的互补DNA(cDNA)，然后再放到原核宿主细胞DNA调控序列的后面表达，从而简化它的转录以及翻译过程。 　　问题2：如何通过cDNA方法获得真核生物目的基因? 　　解析：cDNA合成过程大致如图3所示。 　　 　　 　　 　　 　　 　　第一步，反转录酶以RNA为模板合成一条与RNA互补的DNA单链，形成RNA-DNA杂交分子。 　　第二步，核酸酶H使RNA-DNA杂交分子中的RNA链降解，使之变成单链的DNA。 　　第三步，以单链DNA为模板，在DNA聚合酶的作用下合成另一条互补的DNA链，形成双链DNA分子。 　　问题3：为什么细菌中限制酶不剪切细菌本身的DNA? 　　解析：迄今为止，基因工程中使用的限制酶绝大部分都是从细菌或霉菌中提取出来的，它们各自可以识别和切断DNA上特定的碱基序列。细菌中限制酶之所以不切断自身DNA，是因为微生物在长期的进化过程中形成了一套完善的防御机制，可以将外源入侵的DNA降解掉。生物在长期演化过程中，含有某种限制酶的细胞，其DNA分子中或者不具备这种限制酶的识别切割序列，或者通过甲基化酶将甲基转移到所识别序列的碱基上，使限制酶不能将其切开。这样，尽管细菌中含有某种限制酶也不会使自身的DNA被切断，并且可以防止外源DNA的入侵，达到保护自身的目的。 　　问题4：为什么在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶? 　　解析：限制性内切酶的识别位点可以是4个、5个、6个、8个甚至更多的碱基对(表1)。由于限制性内切酶的识别位点在DNA分子中出现的频率不同，即识别位点序列短的限制性内切酶就会更频繁地切割DNA分子，因此，在分子克隆实验中使用最普遍的是那些识别4个或6个碱基对的限制性内切酶。 　　问题5：如何构建基因文库? 　　解析：在原核生物中，结构基因通常会在基因组DNA上形成一个连续的编码区域，但在真核细胞中，外显子往往会被内含子分开。因此在处理原核基因和真核基因的分离时，要分别采取不同的克隆步骤。 　　在原核细胞中，目的DNA通常在总的染色体DNA中的含量非常少(小于0.02％)。要克隆原核基因，首先要用限制性内切酶对总DNA酶解，然后把这些酶解的DNA片段克隆转进载体，再对带有外源DNA片段的重组克隆进行鉴定、分离、再培养和进一步鉴定。整个过程称为基因文库的构建。从定义上讲，一个完整的基因文库应该包括目的生物体所有的基因组DNA。 　　构建基因文库大多采用一种识别4个碱基序列的限制性内切酶(如Sau3A I)进行酶解，理论上讲它应该是每256个碱基就切一次，调整酶解反应的条件可以使它部分酶解基因组DNA，产生出所有的可能大小的片段(图4)。由于限制性内切酶的位点在基因组DNA上并不是随机排列的，有些片段可能会太大而无法克隆，这时文库就不完整，要找到某一个特异的目的DNA片段也许就要难一些。 　　问题6：目的基因为何必须和运载体结合形成重组DNA才导人受体细胞? 　　解析：基因表达载体构建的目的是使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。要想使新的重组DNA分子在宿主细胞中保存下去，就要求这两个不同来源的DNA分子中至少有一个分子必须提供其在细胞中保存下来所需的生物学功能，这个分子就是基因工程中常用的载体。 　　问题7：运输基因的载体上为何常带有一个或多个标记基因? 　　解析：运载体上的特殊的遗传标记基因，可供重组DNA的鉴定与选择。这里以外源DNA插入到pBR322的Barn HI位点中为例来加以说明：图5是pBR322质