第五讲DNA提取原理及提取技术导论.ppt

DNA的提取原理及提取技术 天然DNA的来源： 1 染色体DNA 原核生物和真核生物均含有染色体DNA,它是分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料。 2 病毒和噬菌体DNA 主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。 3 质粒DNA 很多微生物（大肠杆菌、农杆菌和蓝细菌）都含有质粒DNA，主要用于构建基因克隆载体，也可作为分离目的基因和基因表达调控因子的材料。 4 线粒体和叶绿体DNA 这是真核生物特有的染色体外遗传物质，分别含有与呼吸作用和光和作用相关的基因。主要用于分离目的基因。 植物细胞的化学成分主要有: 1 水、糖类、蛋白质、脂肪以及核酸是生物体所需的基本成分； 2 氨基酸是合成蛋白质的基本原料； 3 果胶、纤维素、半纤维素是植物细胞壁的组成成分； 4 淀粉是光合作用的产物； 5 金属离子主要用来调节细胞的渗透平衡等，比如钾和钠，镁和锰是叶绿素的成分。 植物总DNA提取原则 保证DNA结构的完整性 排除有机溶剂和金属离子的污染 蛋白质、多糖、酚类等降低到最低程度 排除其他核酸分子的污染 植物DNA提取的基本原理 DNA特点： DNA是极性化合物，溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂。 在酸性溶液中，DNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 DNP在盐溶液中的溶解度随着盐浓度的增加而增加。 植物DNA提取的基本原理 DNA提取基本步骤： 1 细胞裂解和DNA的溶解 主要任务：破碎细胞并对DNA实施保护。 采取措施： ⑴利用液氮研磨，使酶失活； ⑵快速加入缓冲液并迅速混匀，对细胞溶浆中DNA进行保护。 EDTA—螯合DNA酶的辅助因子Mg2+和Ca2+,使DNA酶活性降低； SDS—使蛋白质变性并降解蛋白质，也可降低DNA酶的活性； 抗氧化剂—降低酚类氧化对DNA的干扰； PVP—与多酚形成复杂的聚合体，与多糖结合，有效去除多糖； 。。。。。。 植物DNA提取的基本原理 2 与核酸结合的蛋白质及RNA等杂质的去除； 主要利用DNA与蛋白质、多糖等在生化性质上的差别，通过加入离子变性剂，去污剂使蛋白质或多糖变性，核蛋白解聚。 CTAB SDS 除蛋白质 氯仿/异戊醇抽提（氯仿可使蛋白质变性并有助于液相与有机相的分离；异戊醇则有助于消除抽提过程中出现的气泡）。 使用变性剂变性 （SDS、异硫氰酸胍等） 高盐洗涤(当溶液中的中性盐的浓度大于1mol/L 时，蛋白质会沉淀析出 .) 蛋白酶处理 除多糖 高盐法：用乙醇沉淀时，在待沉淀溶液中加入1/2体积的5M NaCl，高盐可溶解多糖。 用多糖水解酶将多糖降解。 在提取缓冲液中加一定量的氯苯(1/2体积)，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖 。 除酚类物质 在抽提液中加入防止酚类氧化的试剂：β-巯基 乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等 加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG(聚乙二醇)，它们与酚类有较强的亲和力，可防止酚类与DNA的结合 除各种离子 70％的乙醇洗涤 注意： 我们在提取某种植物DNA时，需要考虑以上各种杂质的存在，根据某种植物DNA的具体情况采取相应的去除杂质的方法。 植物DNA提取的基本原理 3 DNA的沉淀和纯化 沉淀：无水乙醇 TE缓冲液(10mmol/L Tris-HCl, 1mM EDTA. pH8.0） 作用： ①TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+离子，抑制 DNase ②PH值为8.0，可防止DNA发生酸解 DNA的纯化技术 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 主要用于小剂量DNA的纯化和酶切片段的回收。 1 DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带后，切取含有待纯化DNA带的琼脂糖凝胶电泳块，装入透析袋中； 2 透析袋中加入适量经稀释的电泳缓冲液，并置于稀释的电泳缓冲液中电泳1-2h，使DNA脱离琼脂糖凝胶； DNA的纯化技术 琼脂糖凝胶电泳洗脱法 3 再反向电泳30s-1min，使附着在透析袋膜上的DNA重新进入缓冲液中； 4 吸取透析袋中的洗脱液置于离心管中，以10000r/min离心5min,转移上清液到另一个离心管中，加入3M NaAc，再加入2体积无水乙醇，-20℃放置1.5m