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* 宏基因组功能基因的筛选 WCX 2011年3月17日 目 录 宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法 16S (18S) rDNA测序 宏基因组文库 —功能基因筛选（策略一） 宏基因组的测序 —功能基因筛选（策略二） 宏基因组（Metagenome） Metagenome作为一个新名词最初由美国科学家 Handelsman 及其研究组于1998年提出，定义为“the Genomes of the Total Microbiota Found in Nature”， 即指任何特定环境样品中全部微生物遗传物质的总和, 并且目前主要是指环境样品中细菌和真菌基因组的总和。 Metagenome VS Genome 目 录 宏基因组简介 宏基因组的常用研究方法 16S (18S) rDNA测序 宏基因组文库 —功能基因筛选（策略一） 宏基因组的测序 —功能基因筛选（策略二） Metagenomics involves constructing DNA libraries from environmental DNA Construct 16S (18S) rRNA gene library using PCR sequence Environmental sample Clone into vector eg plasmid, cosmid phosmid, BAC Introduce into host eg E. coli Extract metagenomic DNA Metagenomic library Screen for specific sequences by PCR or hybridisation Functional screening for expression of particular phenotype SIGEX 16S rDNA指的是细菌基因组中编码核糖体16S rRNA 分子的对应的DNA序列，也就是16S rRNA 的编码基因。其长度大约为1500 bp 通过16S rDNA的测序，可以分析环境的群落构成，以及进行细菌的分类和进化分析。 细菌16S rRNA的测序分析 Ashelford 等（2005）通过对4383个细菌16S rDNA的序列进行比对分析，表明16S rDNA 全长序列中包含9个可变区（V1-V9）和10个保守区。其中保守区反映生物物种间的亲缘关系，可变区则表明物种间的差异。 Chakravorty 等（2007）总结16S rDNA 的序列，及其中九个9个可变区和10个保守区的位置和长度，并指出不同的可变区适合不同菌群的鉴定分析。其中V3（约60 bp）和V6区（约70 bp）可以分别用来鉴定大多数细菌。 细菌16S rRNA的V3或V6区的测序分析 16S rDNA 通过设计特异的PCR引物，扩增得到V3或V6区的序列，然后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对V3或V6区进行测序分析，以获得环境样品中细菌等物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。 真菌ITS的高通量测序分析 ITS(Internal Transcribed Spacers )，即核糖体内转录间隔区 ，是位于 28S rDNA的3’端与 18S rDNA的 5’端之间的序列 ITS常用于真菌的分类研究，其长度一般为650-750 bp ITS包含ITS1和ITS2两个区域。其中ITS1 位于 18S rDNA和 5.8S rDNA之间，ITS2位于 5.8S rDNA和 28S rDNA之间 ITS 1 和ITS 2 是中度保守区域, 其保守性基本上表现为种内相对一致,种间差异比较明显。IT S 的序列分析能实质性地反映出属间、 种间以及菌株间的碱基对差异,此外ITS 序列片段较小、 易于分析, 目前已被广泛应用于这种特点使ITS 适合于真菌物种的分子鉴定以及属内物种间或种内差异较明显的菌群间的系统发育关系分析。 通过设计特异的PCR引物，扩增得到ITS序列，然后两端加上接头，便可利用Illumilla的高通量测序技术对ITS进行测序分析，以获得环境样品中真菌等的物种分类、物种丰度、种群结构、系统进化、群落比较等诸多信息。 宏基因组文库 Metagenomic Library 通过PCR 或者杂交筛选特定序列 通过功能筛选特定表型的阳性克隆 环境样品 抽提DNA 克隆(多种载体) 转化适宜宿主细菌(如大肠杆菌) 宏基因组文库的构建 宏基因组文库的分析 宏基因组文库 SIG