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PCR-DGGE 技术 一、 实验原理 变性梯度凝胶电泳（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最早是 Lerman 等 人于20世纪80年代初期发明的，起初主要用来检测DNA片段中的点突变。Muyzer 等人在1993年首次将其应用于微生物群落结构研究。后来又发展出其衍生技术，温度 梯度凝胶电泳（TGGE）。该技术被广泛用于微生物分+生态学研究的各个领域，目前已 经发展成为研究微生物群落结构的主要分子生物学方法之一。 双链DNA分+在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为取决于其分子大小和 电荷。不同长度的DNA片段能够被区分开，但同样长度的DNA片段在胶中的迁移行 为一样，因此不能被区分。DGGE技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂 （鉍素和甲酰胺）梯度，从而能够把同样长度但序列不同的DNA片段区分开来。 一个特定的DNA片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链 行为。一个几百个碱基对的DNA片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续 的碱基组成。当变性剂浓度逐渐增加达到其最低的解链区浓度吋，该区域这一段连续的 碱基对发生解链。当变性剂那浓度再升高依次达到其他解链区域浓度后，最高的解链区 域也发生解链，从而双链DNA完全解链。 不同的双链DNA片段W为其序列组成不一样，所以其解链区域和解链区域的解链 浓度也是不一样的。当进行DGGE电泳吋，一开始变性剂浓度比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一 样。然而一旦DNA片段迁移到一特定位置，其变性剂浓度刚好能使双链DNA片段最 低的解链区域解链时，双链DNA片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧下降。因此同样长度但序列不同的DNA片段会在胶中不 同位置处达到各自最低解链区域的解链变性剂浓度，W此它们会在胶中不同的位置分 开。 然而，一h/变性剂浓度达到DNA片段最高的解链区域变性剂浓度时，DNA片段会 完全解链，成为单链DNA分+，此吋他们又能在胶中继续迁移。因此如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，这些片段就不能被区分开來。在DNA片段 的一端加入一段富含GC片段可以解决这个问题。含有GC夹子的DNA片段最高的解 链区域在GC夹子这一段序列处，它的解链变性剂浓度很高，可以防止DNA片段在 DGGE胶中完全解链。当加入0（3夹子后，DNA片段中基本上每个碱基处的序列差异 都能区分幵來。 二、 实验步骤 样品预处理 样品DNA的提取及纯化 提取方法根据各样品特点自主选择。 3. PCR 扩增 Touchdown PCR method 用于DGGE的PCR引物及Jt?扩增程序： (1) V3区的DGGE引物200bp左右的片段 正向引物： 341F-GC(5’-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGGCCTACG GGAGGCAGCAG-3’)； 5GC-clamp,冇利于检测发生于高熔点区的突变. 反向引物： PCR程序: 94 °C 94 °C 65 °C 72 °C5min (Taq added) lmin518R (59 - GT ATT ACCGCGGCTGCTGG - 3 PCR程序: 94 °C 94 °C 65 °C 72 °C 5min (Taq added) lmin PCR条件： lOx PCR buffer 2.5ul MgCl2(25mmol/L) 2.5ul dNTP(10mM/L) 0.5ul forward-pri(l Opmol/ul) 0.5ul reverse-pri(l Opmol/ul) 0.5ul Template DNA 1-2 ul add ddH2O to 25ul lmin lmin 20 cycles 之后每两个循环降低复性温度rc 94 °C 55 °C 72 94 °C 55 °C 72 °C 94 °C 55 °C 72 °C 72 °C lmin lmin lmin lmin lmin lmin 7min 10 cycles (2) V3?〃5区的DGGE弓|物高于500bp的片段 ?Bacterial 正向引物341 — 357: 341 F-GC(5 ’ -CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCGCCT ACGG GAGGCAGCAG-3’)； 反向引物907—926: 907R(5 ’ CCGTC A ATTCMTTTG AGTTT-39) PCR程序： 94°C 5min (Taq added) TOC \o 1-5 \h \z 9