细胞信号通路检测 总蛋白提取 - 安徽医科大学基础医学院.ppt

病理生理学教研室 背景知识 背景知识 蛋白质表达水平和细胞内定位研究 信号蛋白分子表达水平及分子量检测 Western Blot analysis 信号蛋白分子在细胞内定位研究 IMMUNOHISTOCHEMISTRY/IMMUNOCYTOCHEMISRY IMMUNOFLUORESCENCE (IF) GREEN FLUORESCENT PROTEIN (GFP, LIVE CELLS) 细胞培养 细胞总蛋白提取（本次实验内容） WB 检测信号通路相关蛋白表达 HepG2肝癌细胞，细胞培养皿，细胞刮，RIPA裂解液，PBS，低温离心机，冰盒，EP管，移液器 弃去细胞培养基，4℃预冷的PBS清洗细胞1次 留适量PBS（一般为1ml，大皿可酌情增加）刮取细胞，12000rpm 4℃离心2min，去除上清液。 向细胞沉淀中加入适量RIPA蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制剂）轻吹充分混匀，放置冰上裂解30min（每隔5min涡旋混匀一次） 4℃ 14000rpm离心10min，收集上清至新的EP管中即为蛋白样品 紫外-可见光分光光度计检测蛋白浓度-20 ℃ 保存 为了更好的观测信号通路的活化，蛋白操作过程中应注意哪些问题？ 为何使用WB方法可以检测信号通路的活化？