利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因-中国农业科学.PDF

中国农业科学 2015,48(4):630-645 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.04.02 利用RNA-Seq鉴定甘蓝型油菜叶片干旱胁迫应答基因 卢 坤，张 琳，曲存民，梁 颖，唐章林，李加纳 （西南大学农学与生物科技学院，重庆 400715 ） 摘要： 【目的】利用RNA Sequencing（RNA-Seq）技术比较2种不同生长条件下甘蓝型油菜苗期叶片转录组， 鉴定油菜叶片干旱胁迫应答相关基因，从转录组水平揭示油菜适应干旱胁迫环境的分子机制。【方法】提取正常 生长（ZY）和自然失水处理（ZY8D）的六叶期甘蓝型油菜中油 821 的叶片总 RNA，以 Illumina Hiseq 2000 平台 进行RNA-Seq 分析。利用NGSQCTookit v2.3.3去除低质量和包含模糊碱基的reads。以甘蓝型油菜亲本物种白菜 染色体 v1.5 和甘蓝 Scaffold v1.0 为参考序列，采用 TopHat2-Cufflinks-Cuffmerge-Cuffdiff 标准流程进行差 异表达基因（differential expressed genes，DEGs）筛选。对上调和下调 DEGs 分别采用 Cytoscape v3.1.0 中 的BiNGO和KOBAS2.0进行基因本体（gene ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）代谢途径富集分析。选择上调和下调DEGs各 3 个，以实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）验证 RNA-Seq 结果的可靠性。【结果】过滤低质量 reads 后，ZY 和 ZY8D 分别保留了 26 192 312 和 28 378 899 对高质量 reads 用于 DEGs 筛选，其中 86.6%和 85.8%的 reads 能准确比对到参考序列 上，说明RNA-Seq结果和参考序列可靠。DEGs鉴定结果表明3 657个基因受干旱胁迫诱导差异表达，其中上调表 达基因1 431 个，下调表达基因2 226个。GO富集分析发现上调表达基因主要与非生物胁迫响应和化学刺激响应 相关，其中，参与水分胁迫响应和脱落酸（abscisic acid，ABA）刺激响应的基因分别有 127 和 141 个，而下调 表达基因与植物病原菌防御、蛋白激酶活性和水杨酸（salicylic acid，SA）刺激相关。KEGG富集分析表明上调 表达基因主要富集于苯丙烷和类胡萝卜素的生物合成及淀粉与蔗糖代谢途径，而下调表达基因主要富集于植物- 病原菌互作和植物激素 ABA、SA 和茉莉酸（jasmonic acid，JA）信号转导途径。qRT-PCR 检测 6 个 DEGs 的表达 模式与 RNA-Seq 分析结果一致，证实了 RNA-Seq 结果的可靠性。【结论】RNA-Seq 分析鉴定出 3 657 个甘蓝型油 菜叶片干旱胁迫应答基因。GO和KEGG代谢途径分析明确了差异表达基因富集的分子功能与代谢途径。 关键词：甘蓝型油菜；干旱；叶片；差异表达基因；RNA测序 Identification of Drought Stress-Responsive Genes in Leaves of Brassica napus by RNA Sequencing LU Kun, ZHANG Lin, QU Cun-ming, LIANG Ying, TANG Zhang-lin, LI Jia-na (College of Agronomy and Biotechnology, Southwest University, Chongqing 400715) Abstract: 【Objective 】 To identify the candidate genes involv