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浅述基因文库 　　【摘要】针对新教材中从基因文库中获取目的基因这个知识点内容，展开详细的分析。讲解了基因文库的构建以及如何从基因文库中获取目的基因等。 　　【关键词】基因组文库、cDNA文库、载体 　　在高中生物的新教材选修三专题一中，讲到了目的基因常用的的获取方法，其中第一种方法就是：从基因文库中获取目的基因。什么是基因文库？基因文库有哪些类型？如何构建cDNA文库？ 　　一、基因文库的概念 　　将某种生物体细胞内的总DNA、染色体DNA或者某一组织的mRNA反转录形成的ＤＮＡ，用适当的限制酶将其切成一定范围大小的ＤＮＡ片段，然后把这些ＤＮＡ片段与载体连接起来，导入受体菌中储存，那么这个受体菌的群体就是这种生物的基因文库 　　二、基因文库的类型 　　如果受体菌的群体中包含了某种生物全部的DNA，那么这种文库叫做这种生物的基因组文库，简称Ｇ－基因文库。如果受体菌的群体中只包含了某种生物部分的ＤＮＡ，那么这种文库叫做这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。cDNA文库是把某种生物细胞内的mRNA反转录形成的ＤＮＡ与载体相连接，导入受体菌构建而成的。 　　三、构建基因文库的一般过程 　　构建DNA文库是基因工程的基本操作程序之一，包括下列步骤： 　　⑴载体DNA的制备。包括载体的提取和纯化、限制酶切割、非必须片段的去除、磷酸酶处理等步骤。 　　⑵插入DNA片段的制备。对于基因组文库，这步包括基因组DNA的提取、部分酶切、分级分离等，对于cDNA文库，包括mRNA的提取、mRNA反转录的过程、寡核苷酸街头的加入等。 　　⑶连接产生重组DNA。 　　⑷将重组DNA导入适当的受体菌中。 　　⑸筛选鉴别重组克隆以及扩增和保存文库。 　　从理论上讲，整个过程简单，但在实际得操作过程中，往往会遇到许多的困难。 　　一般来说，构建的基因文库应满足下述几点要求： 　　⑴构建的文库中包含的DNA序列，能代表全部的基因组序列或mRNA序列。这就要求克隆过程中尽可能随机化，不能具有偏向性。 　　⑵构建的文库便于扩增和贮存，以便进行多方面的研究。 　　⑶构建的文库既要有代表性，又要便于筛选。 　　四、cDNA文库的构建 　　1、mRNA纯化 　　构建一个cDNA文库的第一步是分离在某一给定的组织或细胞内表达的mRNA。mRNA仅占细胞总RNA的1%～5%，因而需要另外的纯化技术来富集mRNA。从细胞总RNA中分离mRNA是根据实际上所有真核细胞 mRNA 3端有一长的伸展的腺嘌呤核苷，这个序列被称为poly(A)尾巴，是mRNA分子特有的而其他主要RNA 没有，poly(A)尾通常有足够的长度因而能与人工合成的互补的寡脱氧胸苷酸（oligo(dT)）杂交。正是这种特性使得mRNA从RNA分子的混合物中分离出来。方法有三种： 　　?寡脱氧胸苷酸亲和层析：即分离mRNA的标准方法，将一个寡脱氧胸苷酸（12~18碱基）连接到纤维素的亲和层析柱法，总RNA混合物上样后，mRNA与寡脱氧胸苷酸退火。非poly(A)RNA不结合并很容易从柱子 洗去。用低盐缓冲液洗柱，己结合的mRNA很快洗脱出来。 　　?溶液杂交：本方案也用寡脱氧胸苷酸－纤维素，但不用层析柱，而是将基质直接加到总RNA溶液中。退火和洗涤步骤通过离心含有RNA沉淀的基质在溶液中完成。 　　?生物素标记寡脱氧胸苷酸和链霉亲和素包被磁性球珠：本方案中，一个生物素标记的寡脱氧胸苷酸酸引物在溶液中与总RNA退火，然后加入以链霉亲和素包被的磁性球珠，用磁分离器从大量溶液中分离球珠－mRNA复全体。移去磁分离器，加入洗脱缓冲液，并重复磁性分离步骤。在无盐的状态下，寡脱氧胸苷酸引物从mRNA上解离。 　　2、cDNA第一条链的合成 　　所有合成cDNA第一条链的方法都要用依赖于RNA的DNA聚合酶（反转录酶）来催化反应，有两个关键的因素，一个是mRNA模板，另一个反转录酶。 　　目前商业化的反转录酶主要有两种：一种是禽源反转录酶(reverse transcriptase)，另一种是鼠源反转录酶。一般反转录过程都是采用鼠源反转录酶。GIBCO-BRL公司出品一种鼠源反转录酶，称为SUPERSCRIPT反转录酶，缺少C-末端180个氨基酸，完全去除了其RNAase H酶活性，保持完整的DNA聚合酶活性。 　　3、cDNA第二条链的合成 　　合成cDNA第二条链的传统方法是“自身引导法”，即将第一条链合成过种中形成的cDNA/RNA杂交分子变性，降解RNA，则单链cDNA分子的3末端自身环化，形成发卡结构。以此为引物，在DNA聚合酶作用下合成第二条链。所得到的产物是双链cDNA，在其相当于mRNA5端的地方有一发卡闭环结构。然后用单链特异性的SI核酸酶消化该