脊髓灰质炎病毒空斑试验.ppt.ppt

脊髓灰质炎病毒空斑实验 细胞培养 试验前准备（4人/组） *无菌操作：套脚套，洗手，个人防护器材佩戴，包括：衣帽、口罩、手套。掌握微生物学无菌操作技术。酒精棉球，无菌镊子，记号笔等。 一、传代细胞系培养 1、优点：1) 可以无限的传代。 2) 不少细胞系对病毒很敏感。 3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原的大量生产。 4) 生长旺盛，繁殖快速，对营养条件不苛刻。 缺点：在传代过程中可能会遭到支原体和病毒的污染。 二、传代细胞培养的条件要求 1）细胞密度：2～3×105个/ml(Hela 1:3 or 1:4) 2）pH范围 最适pH7.0～7.4，耐受pH6.6～7.8 3）培养温度 哺乳动物细胞一般为37℃ 昆虫细胞28～30℃ *培养基、分散液的使用 培养基：①加入双抗使培养基双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；②加入胎牛血清使其最终浓度为10%； ③加谷氨酰胺1～2ml于100ml培养基中（使用终浓度为1～4mmol/L ）；④用7.5%碳酸氢钠调整培养基为pH7.2～pH7.4，备用。 分散液：用7.5%碳酸氢钠调整胰蛋白酶溶液为pH7.4～pH7.6，备用。或直接使用0.02%EDTA作为分散液。 *培养方法 1）取长满单层的细胞一瓶，倾去培养液。 2）加入2ml 胰酶消化液或0.02%EDTA(先用5ml 0.02%EDTA 洗1次)，于37℃培养箱放置几分钟，至细胞间出现空隙或细胞变圆后，倒去消化液。EDTA要尽量甩干。 3）加入生长液,反复吹打几次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中（1:3）*。再在每个小瓶中补充生长液至10ml～15ml ，然后置37℃培养箱培养，培养5 ～7天即可长成单层（培养板要做好标记）。 注意事项：若所用液体、器材未彻底灭菌，可导致细菌或真菌污染，细胞生长缓慢甚至停止、死亡。 *Hank’s液、病毒悬液、 2×MEM液体培养基的准备 加入双抗使Hank’s液双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；用7.5%碳酸氢钠调整Hank’s液为pH7.2～pH7.4 用Hank’s液或1×MEM细胞培养基，将Polio V 1型口服疫苗悬液作系列稀释：10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。 加入双抗使2×MEM培养基（45 ℃）双抗最终浓度为1%（双抗储备液为104U/ml）；加谷氨酰胺1～2ml于100ml培养基中（使用终浓度为1～4mmol/L ）；加入胎牛血清使最终浓度为2%；用7.5%碳酸氢钠调整培养基为pH7.2～pH7.4，备用。 将2×MEM液体细胞培养基（胎牛血清浓度为2%）与1%琼脂糖等量混合，保持在45 ℃ 。 病毒（PolioV）在传代细胞中的复制 1、选长满单层的细胞，倒掉（吸出）培养液。 2、接种病毒悬液 0.2 ml/孔，空白对照 加培养液0.2 ml/孔 3、置温箱中置37 ℃吸附1.5～2 h，且每隔15 摇动一次 。 4、然后倒掉（吸出）接种病毒液，铺上45 ℃，含0.5%琼脂糖的维持液覆盖层，2 ml/孔，置室温30 min以上。 5、凝固后倒置，于37 ℃培养48～72 h。 *空斑观察计数 于每孔内加入2 ml甲醛固定20 min，然后甩下琼脂糖覆盖层，用自来水将孔内残渣轻轻冲洗干净。 用1%结晶紫溶液覆盖底层，使瓶壁上的细胞着色10 min ，自来水轻轻冲洗，即可观察细胞空斑并计数。 End 一、意义 由于大肠菌群的生物学特性与肠道病毒之间存在一定差异，因此用大肠菌群来指示经粪便污染水体的病毒学质量有其不足之处。有研究表明大肠杆菌噬菌体 (Coliphage) f2是一种评价水源污染和水处理过程病毒杀灭效率的有希望的指示生物，其主要优点是： （1）大肠杆菌噬菌体 (Coliphage) f2是RNA噬菌体，其核酸性质、粒子大小、 pH稳定性等均与肠道病毒极为接近。（2）大肠杆菌噬菌体经粪便排泄，在水和废水中存在的数目比肠道病毒多，其数量的季节变化也与肠道病毒相似。（3）对外界环境和氯、碘等消毒剂的抵抗力也与肠道病毒相似或略强一些。（4）大肠杆菌噬菌体的检测与计数等方法也较简易。 二、原理 根据f2噬菌体感染大肠杆菌285宿主菌后，可在宿主细胞内增殖、最后裂解细胞的特性，将噬菌体适当稀释，再感染宿主细胞，并利用固体琼脂限制单个感染灶的无限扩散，而形成肉眼可见的空斑。一般而言，每个空斑即由一个噬菌体增殖裂解而成，因此可利用此原理定量检测样品中的噬菌体数量。 三、试剂及培养基制备 略 实验分组： 3人/组 四、实验步骤 大肠杆菌285宿主菌增菌培养： 接种1～2个菌落至10～20 ml营养肉汤液体培养基中，置37 ℃培养10～12 h，备用。 融化2%营