实验2：离以尿素为氮源的微生物.pptVIP

思考： 采用什么方法从土壤中分离出以尿素为氮源的微生物？ 如何判断分离出的细菌确实能将尿素分解？ 一.实验原理 以尿素为氮源的微生物培养一段时间后，由于细菌产生的脲酶向周围扩散，将培养基中尿素的分解，产生的NH3使培养基的pH由原来的中性变为碱性，于是培养基中的酚红变成红色，菌落的周围会产生红色环带，红色环带愈大，表明这种菌利用尿素的能力愈强。 1、配制培养基 尿素培养基 葡萄糖 0.025g NaCl 0.12g K2HPO4 0.12g 琼脂糖 0.5g 酚红 0.25g 尿素 10ml 琼脂和琼脂糖 琼脂是一种未被纯化的混合物，主要成分为琼脂糖和琼脂果胶，还含有少量的含氮化合物，及其它有机杂质和不溶性杂质。琼脂作为微生物固体培养基不可缺少的组成成分，其优点是： ①其主要成分不能被微生物利用； ②可使培养基固化； ③不影响培养基中其他营养物质被细菌吸收。 思考？ 选择培养基 2、倒平板 2、倒平板 3、制备细菌悬液 涂布法分离细菌：在无菌条件下，分别取0.1 mL的稀释度为10-3 、10-4和10-5的土壤稀释液（细菌悬液） ，分别加到装有全营养LB培养基和尿素培养基的培养皿（空白平板）中； 再将保存在70%酒精中的玻璃刮刀放在酒精灯火焰上，待刮刀上火焰熄灭后，在酒精灯火焰旁打开培养皿，将前面已加入的土壤稀释液（细菌悬液）均匀涂布到整个平面上。 接种 取0.1ml菌悬液 涂布分离 1、为什么要用琼脂糖代替琼脂配置固体培养基 因为琼脂是未被纯化的混合物，内含一定量的含氮化合物。如果用琼脂固化培养基，会为细菌提供一定量的非尿素类氮源，这样会在尿素固体培养上产生大量以非尿素为氮源的细菌，不利于以尿素为氮源的细菌的筛选，故用纯化的琼脂糖而不用琼脂做固化剂 2、有脲酶的细菌在生态稳态上起什么作用 如果土壤中有许多尿素，在自然界较高温度下就会被水解，水解后的NH3会使土壤变成碱性，NH3与其他阴离子物质如SO42－、CO32－、NO3－等形成化合物，则会使土壤板结。 有脲酶的细菌使植物废弃物和动物尸体降解，并利用了所形成的氨，有利于自然界中氮的循环。 3、有脲酶的细菌菌落周围为什么有着色的环带出现。 细菌向胞外分泌脲酶，使培养基中尿素水解，水解后产生氨，氨为碱性，酚红在酸性环境里呈黄色，碱性里呈红色。培养基中酸碱指示剂产生颜色变化（变红），标志着存在脲酶水解尿素的作用，从而证明这一菌株以尿素为氮源。 4、与全营养培养基上的菌落数比较，为什么尿素培养基上只有少数菌落 * 实验2 分离以尿素为氮源的微生物 尿素 NH3 中性 碱性 酚红颜色： (酸性)黄色 红色 (变色范围 pH6.4-8.2) 二.实验目的 使用以尿素为唯一氮源的培养基分离细菌(有脲酶) 通过指示剂（酚红）颜色的变化检知培养基pH的变化(脲酶催化的化学反应) 三.实验步骤 ２.倒平板 ３.制备一定浓度梯度的细菌悬液 １g土壤＋９９ml无菌水，振荡，为１０-2稀释液，依次制备 １０-3、１０-4、１０-5的土壤稀释液。 ４.稀释涂布分离法分离细菌 １.制备无菌的全营养ＬＢ固体培养基和尿素固体培养基 ５.培养观察（倒置，37℃ 24-48h） （无菌，0.1ml，玻璃刮刀） LB培养基 蛋白胨： 0.25g 酵母提取液： 0.12g NaCl： 0.25g 琼脂糖： 0.5g 对照组 选择培养基 实验组 为什么用琼脂糖代替琼脂？怎么获得无菌的尿素溶液？ 实验是用琼脂糖代替琼脂作为微生物培养基的固化剂，其目的是：尽可能使培养基中只含尿素一种含氮化合物，以防止琼脂中的含氮化合物被以非尿素为氮源的细菌利用，有利于对这类细菌的筛选。 加入青霉素的培养基: 分离酵母菌、霉菌等真菌 加入高浓度食盐的培养基: 分离金黄色葡萄球菌 不加氮源的无氮培养基: 分离固氮菌 不加含碳有机物的无碳培养基: 分离自养型微生物 加入青霉素等抗生素的培养基: 分离导入了目的基因的受体细胞 ——添加或缺少某种化学成分用于菌种的分离 制备空白平板：取2个三角瓶，分别装入已灭菌的全营养LB固体培养基和尿素固体