牛支原体灭活疫苗的研制与免疫效果-研究.pdf

万方数据 万方数据 万方数据 II 万方数据 摘 要 牛支原体（Mycoplasma bovis ，M.bovis ）是感染牛的一种重要的致病性病原体，主要引起牛的肺 炎、乳腺炎和关节炎等多种疾病。美国于 1961 年首次从患乳腺炎的牛乳中分离得到该病原。国内于 2008 年首次从患肺炎的犊牛肺脏中分离得到，此后在国内逐步蔓延传播，造成了巨大的经济损失， 为研发防控牛支原体病的有效疫苗，在综合前期分析研究的基础上，本文对牛支原体生长滴度测定、 抗原菌悬液浓缩、灭活疫苗制备以及犊牛免疫效果评价等疫苗研发关键技术进行了试验研究，主要 研究内容及结果如下： 1 TTC 应用于牛支原体活菌计数研究及牛支原体扩大培养效果测定 为探讨氯化三苯基四氮唑（TTC ）应用于M.bovis 菌落计数的可行性及实验条件，通过平板计数 法进行了 TTC 浓度筛选；采用倾注培养法对 M.bovis 扩大培养效果进行了菌落形成单位（Colony forming unit，cfu ）计数，通过颜色变化单位（Colour change unit，ccu ）法进行了浓度检测，并测定 了 630 nm 处 OD 值及培养物 pH 的变化。结果：培养基中TTC 质量浓度在 0.3~0.6 g/L 时菌落正常 生长且显色效果明显，TTC 质量浓度较低时菌落显色效果不明显，较高时则会抑制 M.bovis 的生长， TTC 作用最佳质量浓度为 0.4 g/L ；CFU 法测得菌液浓度为 1.8~2.42×108 CFU/mL ，CCU 法测得牛支 原体菌株在 96 h 时的生长滴度为 5.0×108 CCU/mL ，两种方法检测结果基本一致；而不同时段牛支原 体培养物 OD 值变化范围在 0.024~0.213，在对应时间点 OD 值与上述两种方法未表现出一致性，OD 值测定仅可做为培养效果检测时的辅助方法；培养物 pH 变化与 OD 值测定却表现出一定的相关性。 结果表明：TTC 可应用于 M.bovis 活菌计数，菌落呈醒目红色且特征明显，可有效、准确地对 M.bovis 进行活菌计数；CFU 法与 CCU 法均可应用于牛支原体扩大培养效果测定。 2 牛支原体生长曲线测定及不同培养基生长效果比较 通过颜色变化单位法（Colour change unit，ccu ）对牛支原体新疆分离株在牛支原体专用液体扩 大培养基中不同培养阶段的生长滴度进行了测定并绘制了生长曲线，同时采用活菌计数法对牛支原 体菌株在牛支原体专用液体扩大培养基、改良 Thiaucourt’s 培养基、牛心汤培养基、葡萄糖血清肉汤 培养基中的培养效果进行了比较。结果表明：活化培养后的牛支原体菌株在牛支原体专用液体扩大 培养基中生长良好，该培养基相比其他三种培养基具有一定的经济优势，可作为制备疫苗时牛支原 体抗原获取的最优培养基。 3 牛支原体灭活疫苗的研制 采用透析法、高速离心法及超滤浓缩法对 M.bovis 培养物进行了浓缩试验对比研究，测定不同 处理方法浓缩物蛋白含量，并利用 CFU 与 CCU 法测定了超滤浓缩后浓缩液浓度；应用 ISA 206 双 相佐剂制备 M.bovis 灭活疫苗，先后进行了疫苗无菌检测、物理性状检测、稳定性与保存期试验、 动物安全性试验，结果显示超滤浓缩法处理得到的浓缩物蛋白浓度最高，CFU 法与 CCU 法检测结 果基本一致；所制备疫苗物理性状良好，4 ℃可保存 180 d、37 ℃可存放 3 d，受试动物接种后未见 异常反应，注射部位均正常，未见化脓及红肿现象。结果表明：超滤浓缩法适用于 M.bovis 培养物 I 万方数据 的浓缩，可用于疫苗生产时抗原的富集；疫苗安全可靠，为 M.bovis 灭活疫苗的规模化生产提供了 一定的方法与技术支持