吸附层析法柱层析法高效液相层析.PPT

第三十章 层析法测定生化物质 层析技术概述 层析技术概述 因其操作简便、高分辨率、高灵敏度、选择性好、样品量少、结果准确等特点 适合于标本含量少,杂质含量多样品分析 尤其适用于生物样品的分离分析 层析技术成为已成为生物化学及分子生物学常用的分析方法，是生命科学、医学实验技术等研究领域必不可少的手段和工具。 三、层析技术原理 层析系统由两相组成： 一是固定相，另一是流动相 流动相：携带流过整个系 　　　　　统的流体 固定相：静止不动的一相 三、层析技术原理 当待分离的混合物随流动相通过固定相时，由于各组份的理化性质存在差异，与两相发生相互作用（吸附、溶解、结合等）的能力不同，在两相中的分配（含量对比）不同，各组分移动速度各异，因而可将各组份分离 若分部收集流出液，可得到样品中所含的各单一组份，最终达到分离各组分的目的。 四、层析技术分类 四、层析技术分类 吸附层析法(absorption chromatography)：固定相是固体吸附剂，利用各组份在吸附剂表面吸附能力的差别而分离。 分配层析(partition chromatography)：固定相为液体，利用各组份在两液相中的分配系数不同而分离。 离子交换层析(ion exchange chromatography)：是以具有离子交换性能的离子交换剂作固定相，利用他与流动相中的离子能进行可逆的交换性质来分离离子型化合物的一种方法。 四、层析技术分类 凝胶层析（gel chromatography）：固定相为多孔性凝胶，利用各组份的分子大小、形状不同，在凝胶上受阻滞的程度不同而得到分离。 亲和层析(affinity chromatography)：利用待分离物质和他的特异性配体间具有特异亲和力从而与其他组份分离，如免疫亲和层析。 以上各种层析法常应用于柱层析 (column chromatography)中，即将固定相装于柱内，使标本沿一个方向移动而达到分离。 离子交换层析原理示意图 免疫亲和层析 免疫亲和层析 五、高效液相层析 高效液相层析（High performance liquid chromatography，HPLC） 在经典液相色谱和气相色谱的基础迅速发展技术 由于固相填料颗粒小而均匀，会引起高阻力，采用高压输送流动相，可大大加快分析速度，故又称高压液相色谱 高效液相色谱仪一般由高压输液系统、进样分离系统、检测系统、数据系统等组成。 高效液相分析仪结构示意图 五、高效液相层析 正相层析法：固定相极性大于流动相极性 正相层析由于极性化合物更容易被极性固定相所保留 正相层析流出顺序是极性小的先流出，极性大的后流出。 正相层析法一般可用于分离纯化极性大的分子，如磷脂、甾体化合物、脂溶性维生素、前列腺素等 五、高效液相层析 反相层析法：流动相极性大于固定相极性 反相层析流出顺序极性大的先流出，极性小的后流出，与正相正好相反 反相层析用于分离非极性或弱极性化合物，如氨基酸和多肽的分析,蛋白质的分离、碱基、核酸和核酸酶的分析、甾体化合物的分析 五、高效液相层析 反相层析最为常用，优点： 反相层析用流动相的价格比正相层析便宜 对操作环境的污染较小 非极性固定相表面的作用力弱，故色谱柱达到平衡比较快 梯度洗脱的柱子更易于“再生” 二、离子交换层析法测定氨基酸 氨基酸是两性电解质，分子上的净电荷取决于氨基酸的pI和溶液的pH 各种氨基酸分子结构不同，在同一pH值时所带正负电荷的性质不同，所带的电荷量也不同 与离子交换树脂的亲和力有差异 根据从小到大的亲和力顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的目的。 * 1952年真的有应用 图30-1 色谱图 检测器的响应R 基线b 进样峰 进样峰a 进样峰h 1 2 3 时间t(min) tRa tR1 tR2 tR3 二、层析技术发展史 1903年，俄国植物学家茨维特 -将碳酸钙装入玻璃管内，成为柱形 -抽提植物叶子得色素溶液，通过碳酸钙柱 -石油醚洗涤柱子上→下：叶绿素b,a,叶黄素，胡萝卜素 -混合物的不同组分得到了分离 -得到的色带称为色谱，方法命名为色谱法 ① ② ③ ④ 层析法进行时有两个相 固定相（支持物），流动相（含待分离物质）。 固定相-碳酸钙 流动相-石油醚 Michael Tswett (1872 - 1919), the inventor of the method of column chromatography 这是利用色谱法探究生命的启蒙和开端,之后20多年，无人关注这一伟大发明 1931年，德国库恩重复茨维特实验，并分离60多种色素 1938年，从VB中分离B6,出色的研究获得1938年诺贝尔化学奖 1941年，英国生物化学家马丁发展了色谱技术，发现了液-液即分配色谱法 -预测并