蛋白质相互作用研究方法课件.pptVIP

* * * * * * Protein-protein Interaction蛋白质-蛋白质相互作用研究方法 许多生命活动是以蛋白质分子的结合和解离来实现的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为纽带，形成信号转导网络系统。 稳定相互作用 形成蛋白质复合体 （protein complex） 瞬时相互作用 （enzyme-substrate） 生物学效应 稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋白质相互作用的内涵。 蛋白质相互作用关系的复杂性，超出任何个人或特定机构的研究能力。 如何研究蛋白质相互作用？ 酵母蛋白质相互作用联络图 人蛋白质相互作用联络图 如此复杂的相互作用，哪些是有相关功能的？哪些是“噪音”？ 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) 串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 酵母双杂交系统(Y2H) 很多真核生物的转录因子如酵母Gal4 由两个具有不同功能的结构域组成：转录激活结构域(Transcriptional activation domain, AD) 和DNA结合结构域(DNA binding domain, BD) 。 BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基因的上游，AD可和转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。 lacZ UAS AD BD lacZ 两种待检测蛋白(X、Y)分别和AD、BD 融合表达, X与Y之间的相互作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。 lacZ UAS AD Y BD X lacZ 优点：简便、易用、费用低廉，能检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用； 缺点：较高的假阳性，不能真实反映蛋白质在自身细胞中的相互作用，表达的融合蛋白最终要运送到酵母细胞核，而有些蛋白可能具有其他亚细胞定位信号肽等。 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) 串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 串联亲和纯化(TAP) 基因构建：在目标蛋白的一端依次导入钙调蛋白结合肽、TEV蛋白酶切位点和蛋白标签(如蛋白A、寡聚组氨酸肽段等)，进而在宿主细胞中进行融合表达，在生理条件下形成与目标蛋白相互作用的蛋白复合物。 串联亲和纯化 分离纯化： 第一步 利用与蛋白标签具有亲和作用的色谱柱结合标签； 第二步 洗脱后采用TEV蛋白酶断裂TEV蛋白酶切位点； 第三步 利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作用的钙调蛋白色谱柱结合钙调蛋白标签； 第四步 洗脱蛋白，进一步进行鉴定。 串联亲和纯化 优点：能减少非特异性蛋白结合，能保留蛋白复合物在细胞内的修饰和结合状态。 缺点：需要较多的样本材料来提取蛋白，价格比较昂贵, 不能高效检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用。 蛋白质-蛋白质相互作用研究方法 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) 串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP) 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP) 双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC) 荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy transfer, FRET) 两种蛋白在细胞内发生相互作用时会形成两种蛋白的复合物，这样就可以先用一种蛋白的抗体把免疫复合物沉淀下来，然后用另一种蛋白的抗体进行Western blotting 检测。 免疫共沉淀 免疫共沉淀 优点：可以