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液相色谱基础知识 （一）色谱原理及分类 Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations Separations （二）基本概念和术语 液相色谱名词术语（五） 分离原理术语 理论塔板数（N）：用于定量表示色谱柱的分离效率（简称柱效）。是分离效率的量度。 分离度（R）：相邻两峰的保留时间之差与平均峰宽的比值。表示相邻两峰的分离程度。R≥1.5称为完全分离。 （三）液相色谱仪的组成 液相色谱仪的组成 硬件部分 输液系统 进样系统 分离系统 检测器 软件部分——色谱数据处理系统 输液系统 包括溶剂柜、真空脱气机、溶剂混合器、高压泵等，其中核心部分是泵； 泵的作用：提供足够的驱动力使流动相通过填充紧密的色谱柱 洗脱方式 等度洗脱：在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。 梯度洗脱：采用两种（或多种）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定程序连续改变流动相的浓度配比和极性的一种洗脱模式。用于分析组分数目多、性质差异较大的复杂样品。 进样系统 作用：把分析试样有效地送入色谱柱进行分离 要求：进样量重现性好 分类：自动进样器、手动进样器 手动进样器 常用六通阀（以美国Rheodyne公司的7725和7725i型最常见） 进样量应不小于定量环体积的5－10倍（最少3倍） 手动进样器 手动进样器 分离系统 包括色谱柱、柱温箱等 色谱柱是一根填满填料的管子 色谱柱的材料有不锈钢、塑料、玻璃等，主要是不锈钢材质；尺寸（内径、长短）不尽相同； 色谱柱填料主要有硅胶基质和聚合物基质，填料的粒径不尽相同。 检测器 要求：灵敏度高、重现性好、线性范围宽、死体积小、对温度及流量的变化不敏感等 主要有紫外检测器、荧光检测器、示差检测器等 紫外检测器 固定波长检测器 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器 （PDA） PDA是80年代出现的一种光学多通道检测器，它可以对每个洗脱组分进行光谱扫描，经计算机处理后，得到光谱和色谱结合的三维图谱。其中吸收光谱用于定性（确证是否是单一纯物质），色谱用于定量。常用于复杂样品的定性定量分析。 示差检测器 是一种通用型检测器，理论上可以检测几乎所有的化合物 其原理是基于含样品的洗脱剂和洗脱剂二者折光指数的差异。 示差检测器受压力变化、温度变化、流动脉冲的影响较大，不适合进行梯度洗脱。 （四）固定相和流动相 填料基质 无机物基质：硅胶、氧化铝 硅胶是HPLC填料中最普遍的基质 硅胶基质的填料推荐的常规分析pH范围为2－8 有机聚合物基质 化学键合固定相 将有机官能团通过化学反应共价键合到硅胶表面的游离羟基上而形成的固定相称为化学键合相。 化学键合相按键合官能团的极性分为极性和非极性键合相两种。 常用的极性键合相主要有氰基(-CN)、氨基(-NH2)和二醇基(DIOL)键合相。极性键合相常用作正相色谱 ； 常用的非极性键合相主要有各种烷基(C1－C18)和苯基、苯甲基等，以C18应用最广。 流动相的性质要求 低粘度 与检测器兼容性好 易于得到纯品 低毒性 色谱柱对流动相的要求 溶剂使用前都必须经0.45μm（或0.22μm）滤过，以除去杂质微粒； 使用超纯水，或用高锰酸钾处理过的双蒸水；有机溶剂需用色谱纯并与填料相匹配； 缓冲盐pH值在填料允许范围之内，一般为pH 2～8； 缓冲盐浓度低于100 mM； 对样品的溶解度要适宜，最好用流动相溶解样品。（如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。） 液相色谱仪器对流动相的要求 与检测器匹配； 流动相必须预先脱气； 避免用含卤素离子的缓冲液； 溶剂的粘度要低； 防止细菌的生长。 流动相的pH值 分析弱酸样品时通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液 分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。避免用含卤素离子的缓冲液； 流动相中加入有机胺可以减轻或消除峰拖尾现象。这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减