羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白B细胞抗原表位剖析.docVIP

羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白B细胞抗原表位剖析 　　摘要：应用Garnier-Robson法和Chou-Fasman法分析羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域；应用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法和Jameson-Wolf法分析蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数。对各方法的结果综合分析，VirB8蛋白的4-24、80-87、133-160、184-196和229-236位氨基酸区域可能是优势B细胞抗原表位。 　　关键词：布鲁氏菌；VirB8；抗原表位 　　中图分类号：S858.26；S852.61+4 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2014）22-5467-03 　　布鲁氏菌病是由布鲁氏菌引起的一种以人和动物出现流产、不育和发热为临床特征的人兽共患细菌病，在中国人、畜间仍有该病的发生，给人类健康和畜牧业的发展带来严重危害[1]。布鲁氏菌是一种兼性细胞内寄生的细菌，动物感染后常呈隐性，往往到性成熟或妊娠时才表现典型的临床症状，对布鲁氏菌早期感染的检测是有效防控布鲁氏菌病的关键。现在用于布鲁氏菌病检测的主要方法是虎红平板凝集（RBT）和试管凝集试验（SAT），但其存在着灵敏度低和非特异性的缺点，因此，建立一种敏感性高、特异性强的ELISA方法具有重要的意义。 　　VirB8蛋白是布鲁氏菌IV型分泌系统的一个早期分泌蛋白[2]，钟旗等[3]的研究表明，缺失VirB8基因的猪种布鲁氏菌变异株感染BALB/c小鼠后，可保护小鼠抵抗亲本细菌的攻击，证实VirB8基因与布鲁氏菌毒力密切相关。VirB8基因同源性比较表明，其在布鲁氏菌种间的同源性高度保守[4]，因此，VirB8基因可以作为布鲁氏菌基因缺失疫苗、鉴别诊断方法的一个靶基因。张剑等[5]对牛种布鲁氏菌VirB8基因进行原核表达后，以表达的蛋白作为包被抗原建立的间接ELISA方法与虎红平板凝集试验的符合率达97.02%，证明了以VirB8蛋白作为包被蛋白建立间接ELISA的可行性。但是，原核表达蛋白存在着蛋白纯化、生产成本高等缺点，而以抗原表位序列为基础的人工合成抗原多肽有效解决了这些问题。本研究拟对羊种布鲁氏菌VirB8蛋白的B细胞抗原表位进行分析，为后续VirB8蛋白的抗原多肽合成提供信息。 　　1 材料与方法 　　1.1 羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8基因序列 　　羊种布鲁氏菌NN1202株VirB8基因序列为本实验室扩增、测序所得[4]。基因序列已经登录NCBI GenBank，登录号JQ768413。以此基因的推导氨基酸序列为研究对象进行VirB8蛋白的B细胞抗原表位分析。 　　1.2 VirB8蛋白二级结构分析 　　应用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析VirB8蛋白的α-螺旋、β-折叠、转角区域和卷曲区域[6，7]。 　　1.3 VirB8蛋白B细胞抗原表位分析 　　运用Kyte-Doolittle方法、Karplus-Schulz方法、Emini方法和Jameson-Wolf方法分析VirB8蛋白的氨基酸亲水性、蛋白柔性区域、溶剂表面可及性和抗原指数，综合各方法的结果并结合B细胞表位网上VirB8蛋白的B细胞抗原表位预测进行综合分析[8-11]。 　　2 结果与分析 　　2.1 VirB8蛋白二级结构分析 　　综合Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法的分析，VirB8蛋白有4个α-螺旋区域（25-33、36-39、41-45、64-73位氨基酸）；7个β-折叠区域（52-64、73-82、107-116、160-169、172-186、193-207、235-239位氨基酸）。在α-螺旋和β-折叠区域的间隙分布着长短不一的9个转角区域和11个卷曲区域（图1）。 　　2.2 VirB8蛋白的氨基酸亲水性分析 　　Kyte-Doolittle方法（图2）分析表明，VirB8蛋白有2-22、37-45、93-97、116-127、135-158、181-196、229-233等7个氨基酸亲水性区域（≥0.5）。 　　2.3 VirB8蛋白的柔性区域分析 　　Karplus-Schulz方法（图3）分析表明，VirB8蛋白有多个柔性区域，主要位于4-22、38-43、79-87、89-96、115-116、123-127、134-142、144-162、169-178、182-196、213-221和231-235位氨基酸区域。 　　2.4 VirB8蛋白的溶剂表面可及性分析 　　Emini方法（图4）分析表明，3-16、39-43、9