脊尾白虾抗白斑综合征病毒群体初步选育及重要免疫酶活性剖析.docVIP

脊尾白虾抗白斑综合征病毒群体初步选育及重要免疫酶活性剖析 　　摘要：以脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda Holthuis）为试验材料，以人工连续7 d投喂携带白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的死虾为攻毒方式，得抗性试验组（Rm）；以人工连续7 d投喂不携带WSSV的死虾为对照方式，得对照试验组（Vm），待存活率稳定后，分析比较抗性试验组和对照试验组的存活率及酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）活性的差异性；然后待Rm组中雌性脊尾白虾虾卵接近孵化时，挑选40～50尾体格较大的抱卵雌虾，分别放入事先准备好的桶中，让其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各组亲虾并编号，用套式PCR法检测各组亲虾WSSV携带情况，将阴性组及虾卵孵化较少组淘汰，留下20组，重新编号Rm1代，然后将其喂养成成虾；以此方式连续选育得到Rm3代。用同样方法对Rm3代成虾和自然环境中WSSV携带成虾（Vn）进行攻毒试验，然后检测结果显示Rm3代成虾比Vn成虾存活率要高出很多且免疫相关酶活性之间存在显著性差异。 　　关键词：脊尾白虾；白斑综合征病毒；抗病群体；免疫相关酶 　　中图分类号： S945.4+99文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2017）03-0126-03 　　我国是虾类养殖大国，但是随着养殖业的快速扩张，养殖环境恶化、种苗退化和病害高发等因素严重制约了产业的发展[1-2]。其中，虾类病害越来越严重，白斑综合征（white spot syndrome，WSS）的暴发给虾类养殖带来严重损失，这种病毒在虾类个体间可以经口传播，虾类感染后，死亡率极高[3-6]。因此选育出具有一定抗性的群体及对相关免疫酶活性的研究具有重要意义。虾类主要依靠非特异性免疫系统进行自身的免疫防御，其中酸性磷酸酶（ACP）、碱性磷酸酶（AKP）、超氧化物歧化酶（SOD）和酚氧化酶（PO）常被用于衡量虾类的免疫状态、健康状态以及筛选抗病家系等[7-9]。 　　脊尾白虾（Exopalaemon carinicauda Holthuis）属于甲壳亚门十足目长臂虾科白虾属，其环境适应力强、世代周期短且易于人工条件下周年繁殖，是我国常见虾类养殖经济品种[10]。另一方面，脊尾白虾对WSSV敏感性强，在养殖过程中感染WSSV后死亡率极高，容易造成严重的养殖损失。本研究以脊尾白虾为试验材料，通过投喂携带WSSV的死虾为攻毒方式，连续进行3代选育；并分析抗性试验组与对照试验组存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差异，探讨初步选育具有一定抗WSSV的脊尾白虾群体并研究相关免疫酶的活性变化。 　　1材料与方法 　　1.1试验动物和病毒携带虾来源 　　试验所用脊尾白虾：2014年3月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取经套式PCR法检测WSSV携带情况为阴性池塘内的虾，体长为（4.8±0.5） cm，体质量为（1.9±0.4） g； 　　试验用病毒携带死虾：2013年6月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取大规模死亡后经套式PCR法检测WSSV携带情况为阳性池塘内的虾，迅速冷藏运回实验室，并存储于-80 ℃冰柜中待用； 　　试验用自然环境病毒携带虾：2015年6月于江苏省东台市脊尾白虾养殖区选取经套式PCR法检测WSSV携带情况为阳性虾塘内的活体成虾，平均体长为（5.1±0.3） cm，平均体质量为（2.1±0.5） g。 　　1.2WSSV攻毒试验 　　1.2.1抗WSSV群体的获得将试验用脊尾白虾用活水车运输至江苏省海洋水产研究所吕四养殖试验基地，按约5 ∶[KG-*3]1分为试验组和对照组（1 000尾 ∶[KG-*3]200尾），适应性暂养 7 d，期间正常投喂事先检测不携带WSSV的颗粒饵料并及时捞出死虾及残饵，待两组虾稳定后；向试验组投喂携带WSSV的死虾，向对照组投喂不携带WSSV的死虾，每日早晚各投喂1次并及时捞出残饵及死虾，根据前日残饵量及时调整投喂量，连续投喂7 d，得到0代试验组（Rm0）和对照组，以后按正常的管理方法进行换水和投喂颗粒饵料。每天观察虾的存活情况，及时捞出并记录死虾数量，待试验组虾存活情况稳定后，分析比较试验组和对照组的存活率及ACP、AKP、SOD和PO活性的差异性；然后待Rm0组中雌性脊尾白虾虾卵接近孵化（虾卵成亮白色，黑色眼点明显可见）时，挑选40～50尾体格较大抱卵雌虾，分别放入事先准备好的桶中，让其自然孵化，以此得Rm1代；孵化完成后，收集各组亲虾并编号，用套式PCR法检测各组亲虾WSSV携带情况，将阴性组及虾卵孵化较少组淘汰，留下20组，重新编号Rm1代，然后将其喂养成成虾；按以上方法