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青霉素菌株选育技术剖析 　　[摘要]以青霉素生产菌种87117#为出发菌种，采用紫外线诱变复合前体动态后处理的方法，结合限氧条件下的摇瓶筛选，从177支前体抗性株中筛出XY-137#高产突变株。该菌株摇瓶效价平均提高了8.8%，且遗传特性稳定，单位菌丝产物合成能力强。XY-137#菌株在百吨罐中经过近百批的生产验证，其放罐效价、发酵指数、罐批产量平均提高了3.83%、5.66%和2.69%。 　　[关键词]青霉素 菌株 　　[中图分类号]R97 [文献标识码]A [文章编号]1672-5158（2013）06-0461-02 　　由于青霉素原料的后加工与半合成领域愈来愈广泛，世界青霉素市场竞争十分激烈。生产厂家唯有不断地提高生产水平，降低生产成本以增强企业的竞争力，而优质高产菌种的选育和应用是其中的基础和关键。 　　随着青霉素菌种生产能力的提高，传统育种方法的局限性越来越明显。理性化筛选是应用遗传学和生物化学的原理，根据已知或可能的目的产物生物合成途径的调控机制和产物的分子结构，设计筛选方法，定向选出有效的性状突变株。我们依据理性育种的理念，参照现有生产条件设立基本筛选模型，采用紫外辐射震动工业生产菌种稳定的遗传结构，再辅以限氧条件下耐前体突变株的筛选，达到选育高产菌株的目的。 　　一、材料与方法 　　1、出发菌种 　　青霉素生产菌种Penicillium chrysogenum 87117#。 　　2、培养基 　　（1）分离及斜面培养基蔗糖、甘油、酵母粉、NaCl、CaSO4、微量元素、琼脂。 　　（2）种子培养基以蔗糖、玉米浆为碳、氮源。 　　（3）发酵培养基以乳糖、玉米浆为主要碳、氮源，加无机盐类组成。 　　3、菌种诱变与筛选 　　（1）紫外诱变将出发菌株的单孢子悬液置紫外灯下40cm处照射90s。 　　（2）前体动态后处理定量吸取经过紫外线照射后的孢子液，分别加入含有不同剂量的前体（苯乙酸胺）的种子培养基试管中，使每支试管的前体终浓度在0～4.8%之间。将上述试管置25℃恒温振荡培养18h左右，然后稀释分离在固体培养基平板上。 　　（3）前体抗性菌落检出 平板置25℃恒温培养8d。从耐受不同浓度前体处理后长出的抗菌落中挑选孢子相对丰富、组织比较致密的菌落进行斜面传代培养，以备摇瓶筛选。 　　（4）摇瓶定向筛选低氧耗、低菌丝量的高产菌株将摇瓶机转速由通常的220r/min降至160r/min，在低通气条件下进行摇瓶筛选。后续的高产株特性考察和工艺优化均在此条件下进行。 　　摇瓶筛选考察指标为发酵效价和菌丝生长量（packed mycelialvolume，pmv）。 　　4、样品检测 　　发酵液倒入刻度离心管中，3000r/min离心10min。取上清液，用美国OI公司Flow SolutionIV化学自动分析仪检测其中的青霉素效价（u/m1）。沉淀部分所占体积与发酵液体积的比值即为pmv（%）。 　　二、结果 　　1、XY-137#高产突变株的选育 　　出发菌株87117#先经过两次自然选育，然后采用紫外线复合前体动态后处理，挑取177支抗性株，在限氧条件下进行摇瓶筛选。于3.84%前体耐受浓度下获得XY-137#高产突变株，以87117#为对照，其5d和17d摇瓶相对效价分别为107.4%和110.3%，摇瓶效价平均提高了8.8%。 　　2、XY-137#菌株特性考察 　　（1）菌种纯度 XY-137#菌株自然分离后正常型菌落达96.3%，符合上生产罐的要求。 　　（2）斜面周期 XY-137#与出发菌株相比其斜面外观有所改变，孢子长势较弱，颜色明显变浅。若仍按原周期培养斜面，则种子瓶的培养时间需延长4～6h。经过试验比较，将斜面培养周期推后1d，种子瓶生长正常，且摇瓶前期发酵效价略有提高。 　　（3）单位菌丝产物合成能力与出发菌种相比XY-137#菌株的摇瓶效价有显著提高，而菌丝量较低，说明XY-137#菌株单位菌丝产量明显优于87117#对照菌种。 　　（4）稳定性试验 　　XY～137#菌株经斜面传代后进行摇瓶考察，F1～F4代相对效价依次为100%、98，9%、101.1%和99.7%，证明其稳定性良好。 　　3、XY-137#菌株摇瓶工艺优化 　　（1）培养基改良进行了多轮均匀设计试验。种子瓶经回归分析得到的最优配方中，减少了质量不易控制的玉米浆加量，增加适量的无机氮源，碳源比例也稍做了增加，优化后种子瓶的菌浓明显增大，发酵效价提高了7.5%。 　　发酵培养基则基于大罐的用料和配比，尝试添加适量固形有机氮源来稳定摇瓶效价。经摇瓶发酵试验，在多种有机氮源中最终选择加入少量的麸质粉，摇瓶效价提高了6%左右。 　　（2）增加前体补入量 考虑到XY