大型红藻的藻红蛋白分离纯化及低凝固温度琼脂糖制备研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

万方数据 万方数据 学位论文原创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的工作研究及取得的研究成果。论文中除了特别加 以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的研究成果。对本文 的研究做出贡献的个人和集体，均已在论文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担。 作者签名： 日期： 年 月 日 学位论文使用授权声明 本人授权汕头大学保存本学位论文的电子和纸质文档，允许论文被查阅和借阅；学校 可将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其它 复制手段保存和汇编论文；学校可以向国家有关部门或机构送交论文并授权其保存、借阅 或上网公布本学位论文的全部或部分内容。对于保密的论文，按照保密的有关规定和程序 处理。 作者签名： 导师签名： 日期： 年 月 日 日期： 年 月 日 摘要 摘要 摘要 藻红蛋白是一种由多个亚基聚合并结合有色素的大分子量蛋白色素复合物，是红藻中 重要的捕光色素分子。藻红蛋白因其特有的性质，在食品、化妆品、生物医药等行业具有 广泛的用途。目前，由龙须菜制备藻红蛋白的工艺过程是藻体破碎粗提、盐析、多步色谱 层析，这种纯化过程往往存在藻体破碎不充分、回收率低等问题。文中比较了超细破碎， 液氮研磨，直接研磨对龙须菜破碎的效果，结果表明超细破碎法效果最好，藻红蛋白纯度 和溶出率分别为 0.35 和 0.44 mg/g。通过对一步盐析和两步盐析的优化，结果表明最佳的 方法为两步盐析法，盐析条件为第一步 20%的硫酸铵饱和盐析，然后饱和度追加到 45%， 此时藻红蛋白纯度为 0.73，回收率为 66.39%，此纯度达到食品级要求的值（0.7）。文中对 DEAE-52，Q Sepharose Fast Flow，Source 15Q 三种阴离子交换剂的分离纯化效果进行比较， 结果表明 Source 15Q 的分离纯化效果最好，当纯度4.0 时，回收率为 66.09%。紫外可见 光光谱特征表明龙须菜和缢基蜈蚣藻藻红蛋白均属于 R-藻红蛋白，龙须菜藻红蛋白的荧光 发射峰在 578nm，缢基蜈蚣藻在 587nm。龙须菜藻红蛋白的 α、β 和 γ 亚基的相对分子质 量分别为 18kDa、20kDa 和 32kDa，缢基蜈蚣藻藻红蛋白的 α、β 和 γ 亚基的相对分子质量 分别为 17kDa、20kDa 和 33kDa。 随着生物技术的快速发展，琼脂糖尤其是低电内渗琼脂糖受到了广泛的使用。目前琼 脂糖已广泛应用于凝胶电泳，色谱层析，免疫学研究等方面。在琼脂搪的应用中，现代生 物技术和热敏药物包埋等需要较低凝固温度的琼脂糖。本文以真江蓠，龙须菜，硬枝江蓠 为研究材料，首先研究了琼脂糖的制备，工艺流程是碱处理，高温煮胶和硅藻土及活性炭 过滤，最后干燥，并通过红外光谱和 13C-NMR 光谱研究了其化学结构。结果表明由真江蓠 制备的琼脂糖质量最好，测得其电内渗(EEO)为 0.116，硫酸根含量 0.128%，凝胶强度 1024g.cm-2，主要质量标准与 Sigma 公司的低电内渗琼脂糖(A9539)接近。 本文利用响应面优化法对甲基化反应制备低凝固温度琼脂糖的过程进行优化，并通过 红外光谱和 13C-NMR 光谱对低凝固温度琼脂糖的化学结构进行研究。制备的低凝固温度 琼脂糖凝固温度(l.5%，w/v)为 26.7℃，融化温度 (l.5%，w/v) 为 66.7，凝胶强度 (l.5%， w/v) 为 269 g.cm-2。红外光谱图显示修饰后琼脂糖在 1650cm-1 左右处的峰分裂成 1650cm-1 和 1566cm-1 两个峰，琼脂糖甲基化修饰后的 13C-NMR 谱图前后对比结果表明在 59.2ppm I II万方数据 II 万方数据 处有进一明显的-OCH3 信号，这进一步证明琼脂糖修饰成功。 关键词：藻红蛋白，分离纯化，琼脂糖，低凝固温度琼脂糖，甲基化 Abst Abstract PAGE VI PAGE VI 万方数据 Abstract Phycoerythrin belongs to big molecular protein complexes which is composed of several subunits polymerization and combined with pigment. It is an important capture light pigment molecules of red algae. As an important physiological active substance, phycoerythrin is applied in food, cosmetics, biological medicin