脂肪酸去饱和酶在哺乳动物细胞的表达及功能研究.docxVIP

优秀毕业论文 精品参考文献资料 目 录 一、中文摘要 Ⅰ 二、英文摘要 Ⅱ 三、前言 Ⅲ 四、文献综述 1 五、材料与方法 13 六、结果 24 七、讨论 31 八、结论 33 九、参考文献 34 十、致谢 40 十一、英文缩写 41 十二、攻读学位期间发表的论文 44 十三、附图 45 佳木斯大学硕士学位论文 I I 摘 要 目的：实现原生动物小眼虫 Euglena gracilis 的△4 去饱和酶基因 sD4 在哺乳动 物 CHO 细胞中表达，发挥△4 去饱和酶活性；与线虫 C.Briggsae 的△15 去饱和酶基因 sN3 协同作用：在 CHO 细胞中，这两种基因共同作用，只需要在培养基中添加亚油酸和 花生四烯酸作为底物就能合成高含量的 DHA、EPA 等ω-3PUFAs。 方法：首先将小眼虫 Euglena gracilis 的△4 去饱和酶基因 sD4 经过密码子优 化，人工合成后连接到 pcDNA3.1(-)哺乳动物高效表达载体上。同时构建 pcDNA3.1- sN3sD4 双基因表达载体。然后用脂质体法瞬时转染 CHO 细胞。最后采用 RT-PCR 检测基 因在 mRNA 水平的表达，用 GC-MS 检测细胞总脂肪酸含量来鉴定 sN3 和 sD4 基因的功 能。 结果：成功构建 pCDNA3.1-sD4 以及 pCDNA3.1-sN3sD4 高效表达载体；将这二个高 效表达载体成功转染哺乳动物 CHO 细胞；sD4 基因在 CHO 细胞中成功表达，发挥△4 去 饱和酶活性，将 DPA 转变成 DHA，与对照组相比合成能力显著提高。同时，sD4 基因能 与 sN3 基因协同作用，利用△15 去饱和酶作用积累的 DPA 合成高水平的 DHA。 结论：pCDNA3.1-sD4 基因高效表达载体以及双基因表达载体 pCDNA3.1-sN3sD4 的 成功构建，并实现在哺乳动物 CHO 细胞中的表达，合成高含量的 DHA、EPA。为下一步 转基因动物制作以及 DHA 在临床和保健产业的应用打下了坚实的基础。 关键词：ω-3 PUFAs；△4 去饱和酶基因；△15 去饱和酶基因；表达载体；DHA；EPA II II Abstract Objective: △4 fatty acid desaturase gene sD4 which derived from protozoa Euglena gracilis express in the mammalian cell CHO and play its △4 desaturase activity. With the synergythe effect of C.Briggsae △15 desaturase gene sN3, high level of DHA, EPA, and other ω-3 PUFAs can be synthesised . In the dual-gene transfected mammalian cells , only need to add linoleic acid and AA in a medium can be synthesized high level of DHA, EPA and other ω- 3 PUFAs. Methods: After codon optimized and synthetic of the Euglena gracilis△4 desaturase gene sD4 ,we connected to the pcDNA3.1 (-) vector, while building pcDNA3.1-SN3D4 expression vector. Followed by liposome transfection CHO cells ,we use RT-PCR detecting gene expression at the mRNA level, and detect total fatty acid content of cells by using GC-MS to identify their functions. Results: Successfully constructed pCDNA3.1-sD4 and pCDNA3.1-sN3sD4 efficient expression vector; then successfully transfected these three highly efficient expression vector into mammalian cells.The sD4 gene was successfully expresse