丹参酮ⅡA磺酸钠治疗肺动脉高压的作用机制研究-呼吸内科学专业论文.docx

广州医学院硕士学位论文丹参酮ⅡA 广州医学院硕士学位论文 丹参酮ⅡA 磺酸钠治疗肺动脉高压的作用机制研究 PAGE PAGE 3 丹参酮ⅡA 磺酸钠治疗肺动脉高压的作用机制研究 硕士研究生：万利梅 导 师：王 健 教授 中文摘要 【研究背景】： 肺动脉高压(pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺血管壁增厚、重 建为主要特征的肺血管疾病，而慢性低氧被认为是引起肺动脉高压的主要因 素。慢性低氧性肺动脉高压(CHPH)是大部分慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者 最终发展成为肺心病而死亡的主要原因。大量的研究证明，细胞内 Ca2+在血 管平滑肌细胞的收缩和增生的复杂机制中起着至关重要的作用。目前研究发 现低氧时 SOCC(store-operated calcium channel)上调是引起平滑肌细胞内钙离 子失衡的主要原因， SOCC 主要由经典瞬时受体电位 (canonical transient receptor potential ， TRPC) 蛋白家族成员组成，慢性低氧能选择性地引起 TRPC1、6 表达升高。 同时，低氧可以使肺和肺周围血管中的各种促炎因子的表达显著增高，如 TNF-α，IL-1β 以及 IL-6 等。这些细胞因子的过度表达对血管壁细胞的表型， 包括细胞增殖和基质蛋白的表达，以及对缩血管和舒血管物质反应的改变都起 了重要的作用。特别是 IL-6，直接参与了 COPD 以及肺动脉高压的疾病进程。 丹参酮ⅡA 磺酸钠（sodium tanshinone IIA sulfonate，STS）是丹参的有效 成分丹参酮ⅡA 经磺酸化而得到的水溶性产物，最近有研究发现，该药对低 氧性肺动脉高压有保护作用，包括降低平均动脉压、能改善右心室肥厚和平 滑肌增厚程度，但是其机制尚不清楚。 【研究目的】： 本实验建立了大鼠远端 PASMCs (pulmonary arterial smooth muscle cells) 原代培养模型及 CHPH 大鼠模型，观察 TRPC 通道在 CHPH 模型及低氧条件 下培养的 PASMCs 中的表达；观察低氧和常氧状态下 STS 对 TRPC1、6 表达 的影响以及对 CHPH 大鼠血清中和肺组织中 IL-6 表达的影响，探讨 STS 降低 CHPH 大鼠肺动脉压力的可能机制，为寻找有效的防治肺动脉高压的方法打 下坚实的理论基础。 【研究方法】： 本研究采用原代细胞培养和动物实验相结合的方法：（1）胶原酶消化法 培养 PASMCs：分离正常大鼠远端肺动脉，用胶原酶消化培养大鼠肺动脉平 滑肌细胞，通过细胞形态学观察及 α-actin 免疫荧光染色鉴定平滑肌细胞，应 用 real-time PCR 和 Western blot 印迹法检测 STS 对慢性低氧 PASMCs 的 TRPC1、6 的 mRNA 和蛋白的表达，利用 InCyte 细胞内钙浓度检测系统，分 别检测 PASMCs 的基础[Ca2+]i 和 SOCE，从而明确 STS 对慢性低氧大鼠远端 PASMCs 的[Ca2+]i 的影响；（2）建立 HPH 的动物模型：首先，在慢性持续低 氧(10％02)条件下饲养大鼠 3 周建立 CHPH 大鼠模型，分别测定右心室收缩 压、右心室平均压、右心室肥厚指数；应用 real-time PCR 和 Western blot 印迹 等分子生物学方法分别检测低氧肺动脉组织 TRPC1、6 通道 mRNA 和蛋白表 达的变化；用酶联免疫法（ELISA）检测血清中的 IL-6 的含量；real-time PCR 检测肺组织 IL-6 基因表达。 【实验结果】： 一、体外实验结果： 1 、成功建立了大鼠远端 PASMCs 原代培养模型，原代培养的大鼠远端 PASMCs 不仅表现出典型的血管平滑肌细胞的形态学和免疫学特征，而且 具有完好的生理学功能。 2、慢性低氧使大鼠远端 PASMCs 的 [Ca2+]i 和 SOCE 显著升高，不仅如此，慢 性低氧还能使 TRPC1、6 的 mRNA 和蛋白表达升高。 3、STS 可显著抑制慢性低氧诱导大鼠 PASMCs TRPC1、6 通道的上调，同时 降低基础 [Ca2+]i 和 SOCE。 二、体内实验结果： l、成功建立 CHPH 大鼠模型，慢性持续性低氧 3 周大鼠的 MPAP、RVSP、 RV/(LV+S) 都明显增高，HE 染色发现肺动脉血管壁明显增厚、管腔狭窄。 2、CHPH 大鼠远端肺动脉平滑肌的 TRPC1、6 较正常大鼠明显增高。 3、STS 可明显降低慢性低氧大鼠 mPAP、RVSP、RV/ (LV+S)及肺内血管壁厚 度，同时降低慢性低氧大鼠肺动脉组织匀浆中 TRPC1、6