非小细胞肺癌顺铂化疗耐药相关miRNA的筛选鉴定-肿瘤学专业论文.docxVIP

广州医学院硕士研究生论文非小细胞肺 广州医学院硕士研究生论文 非小细胞肺癌顺铂化疗耐药相关 miRNA 的筛选、鉴定 PAGE PAGE 1 非小细胞肺癌顺铂化疗耐药相关 miRNA 的筛选、鉴定 中文摘要 研究背景： 化疗是进展期非小细胞肺癌重要的治疗手段，但是长期的治疗受到化疗耐药 的制约。近来研究表明非编码小分子 RNA(miRNA)与肿瘤耐药的形成有关。微 RNA (microRNA,miRNA)是近年来在真核生物中发现的、在转录后水平负调控基 因表达的一类长约 22 个核苷酸的非编码小分子 RNA。miRNA 生物学效应广泛， 与细胞生长、凋亡、新陈代谢和信号转导等密切相关。miRNA 被报道在各种肿 瘤中表达失常，可能发挥着癌基因和抑癌基因的双重作用。现在越来越多的研究 表明 miRNA 在调节肿瘤细胞对抗肿瘤药物耐药方面发挥着重要作用，如果 miRNA 影响药物吸收、代谢、分布的通道上的基因表达及靶向参与临床功能的 受体有可能导致肿瘤耐药。 为了研究 miRNA 是否参与抗肿瘤顺铂耐药的形成，本实验通过 miRNA 芯片 技术筛选肺癌耐药细胞株与非耐药细胞株差异表达的 miRNA,利用荧光定量 PCR 技术验证相应 miRNA 的表达情况，通过在细胞株中抑制或者过表达目标 miRNA，研究其对化疗药物敏感性的影响，探索以 miRNA 为靶点逆转肿瘤耐药 的治疗及为预测肿瘤化疗敏感性提供新的标志物。 研究方法: 1 细胞培养 人非小细胞肺癌 A549、A549/DDP 细胞生长于含 10%胎牛血清的 RPMI 培养液中，在 37℃，5%CO2，饱和湿度条件下培养，其中 A549/DDP 培养 基含有 1μg /ml 的 DDP 以维持其耐药性。 2 检测 DDP 作用两个细胞株的 IC50 通过递增 DDP 浓度检测 A549、A549/DDP 两个细胞株的 IC50，使用细 胞计数试剂盒 CCK8 检测细胞的活力。酶标仪检测 450nm 波段的吸光值。 3 miRNA 表达芯片检测及数据分析 在细胞生长融合度 70%-85%时，按说明书使用 Trizol 提取 A549 和 A549/DDP 的总 RNA。μParaflo? microRNA 微阵列基因表达实验和分析 由 LC Sciences 公司提供。 4 quantitative RT-PCR 验证芯片结果 提取 A549 和 A549/DDP 的总 RNA，使用 TaKaRa 逆转录试剂盒将 RNA 逆 转录成 cDNA,定量 PCR 反应使用 SYBR? Green Realtime PCR Master Mix 在 ABI 7500 系统平台上进行。 5 miRNA 转染效率的检测 通过对耐药细胞转染 miRNA 模拟物或者抑制剂调控 miRNA 的表达， 荧光定量 PCR 检测目标 miRNA 在细胞中的表达情况，研究能否高效调控 miRNA 的表达。 6 检测 A549/DDP 细胞改变 miRNA 表达后对 DDP 敏感性的影响 对 DDP 耐药细胞 A549/DDP 转染 miRNA 模拟物或者抑制剂，模拟物、 抑制剂的终浓度分别为 50nM、100nM, NC 为转染阴性对照，转染 48 小时 后，使用 CCK8 检测细胞对 DDP 的敏感性，检测波长为 450nm。 7 统计学分析 功能实验的结果用均数±标准差表示，组间差异用 one-way ANOVA 检 验，IC50 应用 probit 回归模型进行计算。统计软件软件采用 SPSS15.0，以 P0.05 作为具有显著统计学差异的检验标准。 研究结果： 1 、 DDP 对 A549 和 A549/DDP 细胞的 IC50 分别为 0.48ug/ml 、 8.64ug/ml,A549/DDP 的 IC50 是 A549 的 18 倍。 2、 miRNA 芯片结果显示耐药细胞株与非耐药细胞株的 miRNA 表达差异 显著, 在 A549/DDP 细胞表达上调最大和下调最大的 miRNA 分别为 miR-376c 和 miR-451。 3、实时荧光定量 PCR 显示，以 A549 细胞为对照组，在 A549/DDP 中 miR-376c,miR-31、miR-29a、miR-221 高表达倍数分别为 3.5、2.5、2.2、3.1 倍， miR-451、miR-196a，miR-20a ，miR-20b，miR-17 低表达倍数为 3.2、4.9、3.0、 7.7、71.4 倍。 4、 经转染 miR-376c 的抑制剂后，miR-376c 在细胞中的表达水平下降了 97.3%，转染 miR-451 的模拟物后，miR-451 的表达水平上调了 1528 倍。 5、