红三叶ISSRPCR反应体系的建立与优化.docVIP

红三叶ISSRPCR反应体系的建立与优化 采用正交试验设计，对影响红三叶 ISSR-PCR反应较大的4个因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、 dNTP及引物)在4个水平上进行筛选，建立并优化了 适合红三叶ISSR分析的最佳反应体系。在25 UL反 应体系中各反应物的最适含量为40 ng模板DNA，10 X PCR-buffer 2.5 u L, 2.5 mmol/L Mg2+, 2.5 U Taq DNA 聚合酶，引物1 u mol/L, 0.2 mmol/L dNTP。反应程 序为：94 °C预变性5 min; 94 °C变性30 s，引物退火 30 s, 72 °C延伸 1 min,循环 35 次；72 °C延伸 7 min, 4 °C保存。优化体系的建立为采用ISSR分子标记技术 进行红三叶种质资源遗传多样性分析提供了技术参考。 关键词：红三叶；ISSR-PCR;正交优化 S541； Q 75 A文章编 号：1009-5500 (2015) 02-0021-06 红三叶(Trifolium pratense)为豆科三叶草属多年 生草本植物，生存5?8年。中国新疆、吉林、云贵高 原、湖北鄂西山地都有野生分布，江淮流域、华南、 西南和西北等地均有栽培，是长江流域以南及甘肃二 阴区优良的豆科牧草［1，2］。红三叶生长速度快、再 生力强、产草量高、草质柔嫩多汁、适口性好、营养 价值高，各种畜禽和鱼类均喜食［3］。目前，三叶草遗 传多样性研宄主要采用RAPD［4，5］、SRAP［6］、SSR［7］ 等技术，而且大多集中于白三叶。对红三叶种质资源 的研究主要集中在栽培技术［8］，株型结构［9］，营养价 值［10］，转基因［11］，异黄酮［12］等方面，利用ISSR标 记研宄红三叶遗传多样性具有实际价值。 ISSR标记是在微卫星分子标记基础上发展起来的 一种分子标记［13］。该技术利用简单重复序列(SSR) 来设计引物，无需预先克隆和测序，操作简单易行。 ISSR引物序列长、退火温度高、特异性和稳定性增强， 可检测到更丰富的遗传变异［14］。ISSR标记结合了 RAPD和SSR的优点，具有模板需要量少，多态性丰富， 无需试剂盒，结果记录方便，试验成本低，操作简单， 试验稳定性高等优点而倍受青睐［15］，广泛应用于生 物研宄的各个领域。近年来，ISSR分子标记技术已开 始应用于草种质资源遗传多样性研宄，在早熟禾(Poa annua) ［16］、鹅观草(Roegneria kamoji) ［17］、燕麦 (Avena sativa) ［18］、披碱草(Elymus nutans) ［19］、 紫花苜蓿(Medicago sativa)［20］＞ 昆仑锦鸡儿(Caragana polourensis) [21]、小花棘豆(Oxytropisglabra) [22] 和扁蓄豆(Ruthenian medic) [23]等牧草上均有报道。 但由于ISSR-PCR是基于PCR的一种标记，其反应条件 易受到各因素浓度的影响，反应体系不同也可产生不 同的结果。为了确保ISSR分析结果的可靠性和重复性， 进行ISSR-PCR反应体系的优化非常必要。利用ISSR分 子标记技术，以国外引进的10份红三叶种质为材料， 以红三叶基因组DNA为模板，采用正交实验设计[24] 对ISSR-PCR反应体系进行优化，探讨反应体系中随机 引物、dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+等的浓度以及反 应的退火温度和循环次数等因子对红三叶基因组的 ISSR扩增效果的影响，旨在建立一种用于红三叶的 ISSR-PCR反应体系，为进一步开展红三叶遗传多样性 研宄奠定基础。 1材料和方法 1.1试验材料 供试的10份红三叶材料（表1），均种植于甘肃 省中部的榆中县良种场，在生长期采集新鲜叶片， 于-80 °C冰箱保存备用。 表1试验材料及来源 Table IThe sampled materials and source 序号名称来源 1ZXY2008-P4596 俄罗斯 2ZXY2008-P4718 俄罗斯 3ZXY2008P-4820 俄罗斯 4ZXY2008P-4847 俄罗斯 5ZXY2008P-4858 俄罗斯 6ZXY2008P-4907 俄罗斯 7ZXY2008P-4914 俄罗斯 8ZXY2008P-4924 俄罗斯 9ZXY2008P-4996 俄罗斯 10ZXY2008P-5004 俄罗斯 1.2试剂 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、PCR Buffer、引物、MgCI2、 Maker均来自上海生工。ISSR引物参照加拿大哥伦比 亚大学（UBC）提供的ISSR引物序列，由上海生物工 程有限公司合成。 1.3基因组DNA的提取与检测 采用改良的CTAB法