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当归对血虚便秘模型小鼠结肠水通道蛋白8表达影响 　　摘要：目的 观察当归对血虚便秘模型小鼠?Y肠水通道蛋白8（AQP8）的表达及AC-cAMP-PKA信号通路各因子含量的影响，探讨当归润肠通便作用机制。方法 60只KM小鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和当归高、中、低剂量组，每组10只。采用复方地芬诺酯、乙酰苯肼及环磷酰胺联合复制血虚便秘小鼠模型，实验第14日起，当归高、中、低剂量组分别给予16.7、8.8、4.2 g原药材/kg当归水煎液灌胃，阳性药组给予5.0 g/kg常通舒颗粒药液灌胃，正常组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，观察小鼠血虚便秘证候、排便时间，免疫组化、Western blot和qRT-PCR检测小鼠结肠AQP8蛋白和mRNA的表达，ELISA检测小鼠结肠AC-cAMP-PKA信号通路中各因子的表达。结果 模型组小鼠出现血虚便秘证候，粪便排出时间较正常组明显延长（P 　　Keywords： Angelica Sinensis Radix； blood-deficiency constipation； aquaporin 8； AC-cAMP-PKA； mice 　　当归是伞形科植物当归Angelicae sinensis （Oliv.）Diels的干燥根，具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效。古医籍记载以当归配伍治疗血虚便秘，如《沈氏尊生书》“润肠丸”，《脾胃论》“导滞通幽汤”；当代名中医亦喜用当归配伍治疗血虚便秘，如李国峰自拟养血润肠方[1]，张东岳的“秘宝康”[2]等。以上方剂均以当归组方治疗血虚便秘疗效较好，但当归润肠通便的药理机制尚不十分明确。有研究表明，结肠黏膜水通道蛋白（AQP）8在粪便的水分吸收、黏液的分泌中发挥重要作用[3]。有研究表明，AQPs C末端磷酸化对其活性有调节作用，文献证实AC-cAMP-PKA途径参与了AQPs的表达调控[4]。本研究采用复方地芬诺酯、乙酰苯肼及环磷酰胺复制血虚便秘小鼠模型，观察当归对血虚便秘模型小鼠结肠AQP8的表达及AC-cAMP-PKA信号通路各因子含量的影响，探讨当归润肠通便作用机制。 　　1 材料与方法 　　1.1 动物 　　SPF级KM小鼠60只，6～8周龄，体质量18～22 g，雌雄各半，甘肃中医药大学科研实验动物中心，动物许可证号SCXK（甘）2015-0002。饲养于甘肃中医药大学SPF级动物实验中心，室温22～26 ℃，相对湿度60%，自然昼夜光线，适应性饲养3 d。 　　1.2 药物及制备 　　当归，兰州复兴厚药材有限公司，批号160502，经甘肃中医药大学刘峰林副教授鉴定为正品。称取当归饮片，加8倍量水浸泡1 h，煎煮1 h，过滤，药渣加6倍量水煎煮1 h，合并2次滤液，过滤，浓缩至1.7 g原药材/mL，消毒后分瓶、压盖包装，冰箱保存备用。复方地芬诺酯片，常州康普药业有限公司，批号160502；乙酰苯肼，上海源叶生物科技有限公司，批号20150701258；环磷酰胺，江苏恒瑞医药股份有限公司，批常通舒颗粒，贵州威门药业股份有限公司，批号160101。 　　1.3 主要试剂与仪器 　　GAPDH抗体，美国ImmunoWay公司，批号B4501；SP检测试剂盒、DBA显色试剂盒，北京中杉金桥生物科技有限公司，批号16183A09、K162418A；Trizol Reagent，美国Invitrogen公司，批号108303；Nuclease-Free water，上海前尘生物科技有限公司，批号0000124196；Fast Quant cDNA第一链合成试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司，批号04102；GoTaq? qPCR Master Mix，普洛麦格（北京）生物技术有限公司，批号0000161385；R0010 RIPA组织裂解液、PMSF、10×丽春红染色液、BCA蛋白测定试剂盒、SDS凝胶制备试剂盒、4×蛋白上样缓冲液、甘氨酸、SDS、Tris，北京索莱宝科技有限公司，批号分别201611082016110420161115、1203P0614、1207G033、2016S075；山羊抗兔二抗，美国ImmunoWay公司，批号B0101。Benchmark? Plus酶标仪，美国Bio-Rad公司；BX51-32H01型显微镜，日本Olympus公司；低温高速离心机，美国Biofage fresc公司；vortexer振荡涡旋混合器，德国IKA公司；1008E型掌上离心机，大龙兴创实验仪器（北京）有限公司；SMA2000Thermo超微量分光光度计，Thermo Fisher Scientific；Bio-rad iCyc