根癌农杆菌介导的CaNZ基因转化烟草的研究-生物化学与分子生物学专业论文.docx

学位论文原创性声明 本人郑重声明:所呈交的论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的 研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写的成果作品，也不包含为获得中南林业科技大学或其他教育 机构的学位或证书所使用过的材料。对本文的研究作出意要贡献的个人和集体， 均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 作者签名: 切和 ìvο平手 6 月 Ir 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规 定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件成 电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权中南林业科技大学可 以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可 以来用影印、缩印成扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于:  1、 保密口，在年 2 、 解密后适用本授权书。 3、 不保密的。 (请您在以上相应方框打 .J )  污 作者签名: 豆 J和 :8 乍 b 月 rrR  导师签名: ，毡_，!T07年 6 月tJR ?啡，-￥ ?啡， 确土毕业论文 根棉农杆菌介悖的 CaNZ 基因转化烟草的研究 摘要 CaNZ 是 CaN (Calcineurin) 基因的正义表达基因，是在真核生物中存在的一 个 Ca2φ 及 CaM 依赖的 Ser/Thr 蛋白磷酸酶，它包括一个催化亚基 calcineurin A 和 一个 Ca2+结合亚基 calcineurin 日，其催化亚基 calcineurin A 活性受 CaM 调节。本 实验在筛选烟草高效再生体系基础上，利用带有信号肤和 CaM 结合肤的载体，以 农杆菌为媒介将 CaN 幕因导入烟草中，预期过表达的融合蛋白将会被分泌到细胞 外并与质外体 CaM 相结合，抑制质外体 CaM 的功能，从而构建出质外体 CaM 的反 义植株，观察质外体 CaM 反义植株的表型改变，为进一步开展 CaM 在植物生长发 育过程中的功能研究提供基础。 研究结果如下: (1)以 14-16d 烟草叶片为外植体，以 MS 为基本培养基，通过附加激素配方 对比，筛选剧适合材料再生的最佳培养基配方: MS+IAA O. 5mg .L飞 6-BA 1.5mg .L-1 为芽分化的培养基， 1/2MS + NAAO. lmg ? L-t 为生根培养基。 (2) 用 Kan 进行烟草叶片抗性筛选。当 Kan 浓度小于 50mg ? L-t 时，叶片能 正常分化出芽;当 Kan 浓度为 75mg ? L-t 时，叶片大多数自化:当 Kan 浓度超过 100mg ? L-t 时，芽分化停止。所以，以 Kan 浓度 100mg ? L-1 为烟草叶片分化芽抗 性筛选的 l临界浓度:而培养物根对抗生素较为敏感， Kan 50mg ? L-t 为筛选临界值。 通过对烟草叶片转化过程中各种条件的比较试验，获得其转化最佳条件为:叶片 预培养 3d 后，在 10 倍稀释 (OD600 =0.8) 的根癌农杆菌菌液中浸染 6 8min ，然 后放贺子铺有…层无菌滤纸的分化培养基上共培养 3do (3) 以抗性植株的总 DNA 为模板，以质粒 DNA 为阳性对照，以为转化植株为 阴性对照，利用外援基因的特异引物进行 PCR 扩增，结果表明， 37 株转化苗中有 21 棵检测结果为阳性，转化效率为 56. 7%。初步证明CaNZ 基因已经转入烟草基因 组中。 (4) 大部分 PCR 检测为阳性的转化植株句对照植株相比，生长缓慢，株型矮 小，种子成熟期推迟。 关键词: CaNZ 基因:遗传转化:根癌农杆菌:烟草 11 11 顿上毕业论文 根癌农杆菌介导的 CaNZ 基因转化烟草的研究 ABSTRACT CaNZ is the CaN plus-sense gene. CaN is a Ca2+/CaM-depended Ser/Thr proteinphosphotase  eXlsting  1n the eucaryons，which  includes  a catalytic subunit-calcineurin A and a Ca2+ combined subunit一-calcineurin B. The activity of calcineurin A is regulated by CaM. According to the researching methods for animals， through the pu叩ose gene transfered by Agrobacteritunm ，fusion