QIAampViralRNAMiniKit中文说明书.docVIP

QIAamp_Viral_RNA_Mini_Kit中文说明书 大致流程: QIAamp Viral RNA Mini Kit利用了硅胶膜的选择吸附的特性，结合真空或分离柱处理，是同时纯化多个样品的理想选择。先将样品在高变性条件下裂解，灭活RNase，确保病毒RNA的完整性。调节buffer至QIAamp膜吸附RNA的最佳条件，将样品转入QIAamp Mini column。RNA与膜结合，而其他污染物则用两种不同的洗液分两步除去。用特殊的Rnase-free缓冲液洗脱得到的高质量的RNA，可以直接进行下游实验，也可储存备用。纯化产物无蛋白质，核酸，其他杂质和抑制剂污染。无需酚/氯仿抽提或酒精沉淀，QIAamp膜就可以保证高纯，完整的RNA的极高回收率。所有缓冲液和试剂都保证是无Rnase污染的。 注意: 1. 样品如果是冷冻保存的，要避免反复冻融。否则会导致蛋白质变性沉淀，降低病毒效价，最终减少产量。此外，沉淀还会堵塞QIAamp膜。若产生了沉淀，可以通过6800×g，离心3min，小心吸取上清进行实验。 2. 在将样品放入QIAamp分离柱前，一定要将裂解液的条件调至病毒RNA的最佳吸附条件。如果起始样品量较大，超过了140ul，那么最好分几次放入分离柱。 3. 如果样品中存在细胞DNA，那么纯化过程中DNA会与病毒RNA一起提取出来。为避免此现象的发生，推荐用无细胞液体提取病毒RNA。如果样品中含有细胞，如脑脊液，骨髓，尿液等，应该先过滤，或者1500×g离心10分钟，然后取上清。如果RNA，DNA一起分离了出来，洗脱液可以用Rnase-free的Dnase进行消化，然后70?，15min失活Dnase。 4. column可以吸附大于200核苷酸的RNA，产量取决于样品大小，样品保存和病毒效价。流程推荐的起始样品量为140ul，不过280ul也是可以的。上柱前，小量的样品要用PBS调节到140ul，而低效价的样品要先行浓缩到140ul。对大于140ul的样品，上柱前所用的裂解液和试剂都应该相应增加，但用于洗涤步骤的缓冲液AW1和AW2通常无需改变。如果起始样品量比较多，建议将裂解样品分多次进行上柱。无需担心柱子会超载，纯化产物的质量也不会受影响。样品量超过560ul时，最好先浓缩样品。 需准备的东西(分离柱法): 无水酒精(96,,100,);1.5ml离心管;灭菌，Rnase-free枪头，离心机(适用于1.5ml和2ml离心管)。 试剂准备: 1. 吸取310ul buffer AVE加入到装有310ug冷冻carrier RNA的管子中，配成1ug/ul的溶液。充分溶解后，将其分成合适的等份，,20?冻存。反复冻融不要多于3次。 2. 检查buffer AVL的沉淀情况，必要的话可置于80?温育至沉淀溶解。按照表1及公式计算一批样品所需的buffer AVL-carrier RNA混合物的体积(说明书15,16页写的比较清楚，不再详述)。轻柔的颠倒混匀10次，不要涡旋，避免产生泡沫。(Note:buffer AVL-carrier RNA应该现用现配，2,8?可保存48小时。用前，存放时产生的沉淀必须在80?加热重新溶解。溶解次数要小于6次。80?加热不能超过5min。) n x 0.56 ml = y ml y ml x 10 μl/ml = z μl n = number of samples to be processed simultaneously y = calculated volume of Buffer AVL z = volume of carrier RNA–Buffer AVE to add to Buffer AVL 因此，carrier rna溶解在ave之后就大概5.6ul每管分装，或者10.2也可。之后冻存，由于其冻融不能超过3次。 buffer AW1在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇(96,,100,)稀释。(,52904 19ml AW13. 需加入25ml乙醇)说明书17页 4. buffer AW2在用前需按照瓶子上的说明，加入无水乙醇(96,,100,)稀释。(,52904 13ml AW1需加入30ml乙醇)说明书17页 柱子的使用(分离柱法): 要避免交叉污染。 1. 样品上柱时要小心，不要弄湿柱子的边缘。 2. 在所有的移液步骤中注意要换枪头。 3. 枪头主要不要碰到QIAamp膜。 4. 斡旋后瞬时离心1.5离心管，将盖子上的液体甩下来 5. 全程带手套，一旦手套接触到样品，立即更换手套。 6. 放入离心机离心前要盖上column。 7. 将column和收集管从离心里拿出后，将column放入新的收集管内。丢弃